中药提取物对猪源耐药大肠杆菌分离株的抑制作用

肖莉春，孔祥峰，黄名钱，郭小权

(1.江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045;2.中国科学院 亚热带农业生态研究所/湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心，湖南 长沙 410125)

猪大肠杆菌病是由某些特定血清型大肠埃希氏杆菌(E.Coli)感染引起的，该病在临床上的主要表现为严重腹泻、脱水或败血症，患猪生长停滞或死亡，对仔猪危害较大，给养猪业带来巨大经济损失[1]。由于临床上抗菌药物的滥用导致E.Coli的耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，严重危害了养猪业的健康发展[2]。并且长期处在选择性压力作用下，病原菌维持耐药性，且可能通过质粒和整合子将耐药基因在相同或不同种属细菌间广泛转移，最终导致多重耐药，加大了控制病原菌的技术难度。从动物排放到环境中的病原菌可以长时间存活，而在环境中不断迁移的过程中，病原菌也会通过自身的变异获得更强的致病力，对人类及动物造成严重威胁。随着人们对抗菌药和激素等常规药物毒副作用的认识不断加深，以及目前人们对食物安全的广泛关注，兴起了一股崇尚和回归自然的浪潮[3]。中药及天然植物制剂因来源广、多效等优势，具有药用、保健和营养等作用，且其毒副作用低、无有害残留、不易产生耐药性，有很大的应用价值，已愈来愈被国内外畜牧兽医工作者所重视[4－5]。本试验制备了29味中药的水提物和中性醇提物，并采用打孔法、倍比稀释法测定了其对10个猪源耐药大肠杆菌分离株和3个标准大肠杆菌菌株的抑制活性，旨在为研制高效抑菌中药方剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

10个猪源大肠杆菌分离株由扬州大学焦新安教授课题组提供，其编号、血清型、基因型、毒素鉴定情况及耐药谱如表1、2所示，3个致病大肠杆菌标准株(K88、K99、K101)由中国科学院亚热带农业生态研究所畜禽健康养殖研究中心提供。

表1 10株猪源大肠杆菌分离株的情况Tab.1 Information of 10 isolates of E.Coli from swine farms

表2 10株猪源大肠杆菌分离株的耐药表型Tab.2 Antibiotics－resistance phenotypes of 10 isolates of E.Coli from swine farms

1.2 中药提取物制备

试验选用的29味中药(表3)均购自湖南省长沙市药材公司。

表3 中药来源Tab.3 Resources of Chinese herbs

中药水提物的制备:取每味中药各100 g，加500 mL蒸馏水，武火加热至沸腾，然后改用文火加热，维持微沸1 h，期间不断搅拌，4层纱布过滤;在药渣中再加入500 mL蒸馏水，同法煎煮、过滤。合并滤液，加热浓缩至1 g/mL，于－20℃保存备用。

中药中性醇提物的制备:取每味中药各100 g，加500 mL的80%乙醇于1 000 mL圆底烧瓶中，加热回流1 h，趁热过滤;在残渣中再加入500 mL的80%乙醇，加热回流1 h，滤出残渣，合并滤液，在旋转蒸发仪中加热浓缩至1 g/mL，于－20℃保存备用。

1.3 中药提取物对大肠杆菌抑菌圈的测定

将菌株接种于LB固体培养基上，37℃培养24 h，然后挑取单个菌落接种于LB液体培养基中，37℃摇菌培养6～8 h，用分光光度计测定其OD600值，然后将菌液稀释成浓度为1×107cfu/mL的菌悬液，取稀释后的菌悬液100 μL于LB平板内，用无菌涂布棒涂匀，再用直径6 mm的无菌打孔器在每个平皿内均匀打5个孔，挑去孔内琼脂，在酒精灯上加热封底，每孔加入对应标号的中药提取物，以刚刚注满为准，37℃培养24 h后，测定抑菌圈直径[6]。

1.4 中药提取物对大肠杆菌MIC的测定

采用倍比稀释法[6]。对筛选出具有明显抑菌活性的中药提取物，在48孔板上用LB液体培养基将药液稀释成500，250，125，62.5，31.25，15.6，7.8 mg/mL 7 个浓度梯度，每孔加入稀释后的菌液100 μL，混匀后37℃培养24 h。若培养液透明，可直接判定结果;若培养液色泽较深，不易判定结果，则在培养结束后，取适量培养液在固体培养基上划线接种，培养24 h后观察结果，以无菌生长的最低稀释度为各受试提取物的MIC。

2 结果与分析

2.1 中药提取物对大肠杆菌的抑菌圈直径

由表4可见，五倍子醇提物和水提物对受试菌的抑菌圈直径分别为＞20 mm和9.5～13.0 mm，连翘提取物的抑菌圈直径均为10.0～14.0 mm;地榆、秦皮提取物对菌株C023、SEC1284均表现出较强的抑菌活性;山楂醇提物对菌株 SEC470、SEC817、K101和 SEC1284的抑菌圈直径分别为 11.0，10.3，10.0，10.0 mm，秦 皮 醇 提 物 对 菌 株 SEC470、C023、SEC1284、K99 和 C193 的 抑 菌 圈 直 径 分 别为 13.3，10.3，10.3，10.0，10.0 mm，黄连醇提物对菌株 SEC1284、SEC470 和 SEC206 的抑菌圈直径分别为 16.0，15.0，10.0 mm;大青叶水提物对13 株受试菌的抑菌圈直径均介于 7.0 ～10.5 mm。

表4 中药提取物对13株大肠杆菌的抑菌圈直径Tab.4 Inhibition zone diameter of extracts from Chinese herbs against 13 strains of E.Coli mm

2.2 中药提取物对大肠杆菌的MIC

由表5可见，五倍子醇提物对13株受试菌的抑制效果最佳，MIC为15.6 mg/mL，而其水提物的MIC为125～250 mg/mL;连翘提取物的抑菌效果次之，MIC为62.5～125 mg/mL;山楂醇提物对13株受试菌的MIC为125～250 mg/mL，而其水提物除对除SEC616、SEC911、C193和C197外的其它菌株的MIC均介于250～500 mg/mL;地榆、黄芩、秦皮和大黄提取物的MIC均偏高，抑菌效果较差;大青叶水提物的MIC为250～500 mg/mL，而其醇提物无抑菌活性;栀子提取物对13株受试菌的抑制效果均不明显。

表5 中药提取物对13株大肠杆菌的MICTab.5 MIC of extracts from Chinese herbs against 13 strains of E.Coli mg/mL

3 讨论

中药的抑菌成分主要有生物碱、黄酮、挥发油、有机酸和帖类等物质。本试验分别用水提法和中性醇提法制备了29种中药的提取物，并比较了其对耐药性大肠杆菌的抑制作用。结果表明，11种中药的两种提取液对13株受试菌均有不同程度的抑制作用。其中，五倍子醇提物对13株受试菌，秦皮醇提物对 K88、K101、SEC206、SEC470、SEC616、SEC1284 和 C197，石榴皮醇提物对 K99、C023、SEC470、SEC1284和C193，黄连醇提物对SEC206、SEC470和SEC1284，大黄醇提物对SEC1284的抑制作用均大于其水提物，这与以往报道五倍子[7]、秦皮[8]、石榴皮[9]和大黄[10]醇提物的抑菌效果最佳相符。在 13株受试菌中，黄连提取物对SEC470和SEC1284、地榆提取物对C023和SEC817、大黄提取物对SEC1284抑菌活性较强，对其它菌株的抑制作用较弱或无抑菌效果。可见，同种中药的不同提取方法所得的提取液对同一菌株的抑制作用有显著差异，同一中药提取液对不同菌株的抑制作用也存在差异。

水提法以水为溶剂，操作简便，成本低，但其选择性差，只有一些无机盐、可溶性多糖、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐等成分能被溶出。水提过程中温度较高，极可能破坏热稳定性较差的有效成分，使其提取液的抑菌效果较弱[11]。乙醇的溶解性能比水好，对中药细胞的穿透能力较强，醇提液中除了含有水溶性成分还含有脂溶性成分。目前研究认为，五倍子的主要抑菌成分为五倍子鞣质和没食子酸等，可使微生物体内的原生质凝固[12];黄连的有效抑菌成分为小檗碱，黄芩的主要抑菌成分为黄芩甙[13]，秦皮的抑菌成分为秦皮甲素和秦皮乙素(香豆精)等[14]，石榴皮的抑菌成分为黄酮和鞣质等[15]，大黄的抑菌成分为大黄素、芦荟大黄素和大黄酸等[16]。在上述抑菌成分中，生物碱、黄酮类、挥发油、帖类、蒽醌和香豆精等均能溶于乙醇，所以中药醇提物的抑菌作用一般强于其水提物。

综上所述，本试验筛选出了几种对猪源耐药大肠杆菌分离株具有较强抑制作用的中药提取物，为研制高效抑菌中药方剂提供了依据。某些中药成分在体内代谢可生成无效或低效的代谢产物;而一些在体外无抑菌活性的成分，通过体内代谢可产生具有较强抑菌活性的代谢产物。因此，需进一步通过体内试验并结合临床用药效果观察，才能最终筛选出效果良好的抑菌中药。

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