乙型肝炎病毒基因组1896位点变异株与野生株的定性检测＊

郭龙华，陈 茶，万泽民，何文军，吴新忠，周 强，冯春颜，吴文权

（1.深圳市龙华人民医院检验科，广东 深圳 518109；2.广东省中医院检验科，广州 510120）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是不完全双链环状DNA病毒，HBV复制过程中要经过逆转录，由于逆转录酶缺乏有效的碱基校对功能，故HBV基因组比一般DNA病毒易发生变异［1－3］。HBV前C区定位于乙肝病毒基因组nt1814－1900，前C区是HBV基因组的高变区，前C区最常见的变异为G1896A点突变，使第28位密码子TGG→TAG（终止子），翻译提前终止，导致 HBeAg阴转，影响干扰素疗效［4－5］。目前一些常用方法对前C区1896位点变异株与野生株的混合感染易漏检，本文介绍的方法能同时定性检测前C区1896位点变异株与野生株，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清标本 来源于广东省中医院2011年1月至2月门诊和住院患者，共收集40例HBV DNA含量高于1×104IU／mL血清标本。

1.1.2 主要仪器 Roche公司LightCycler型荧光定量PCR仪、法国VL公司Bio－1D型凝胶成像仪、飞鸽牌TGL－16B台式高速离心机。

1.1.3 主要试剂 广州达安基因公司HBV DNA荧光定量PCR检测试剂盒、蛋白酶K（Merck公司）、平衡酚（国产），裂解液（自配）。Taq DNA 酶（MBI公司）、dNTP（Promega公司）、DNA Marker（TaKaRa公司）。

1.1.4 引物设计与合成 参照GenBank中的HBV基因组序列，用Primer Premier 5.0软件设计3条特异性引物：正义引物P1：5′－GAC TCT CAG CAA TGT CAA CG－3′（nt 1669－1688）；反义引物P2：5′－CGG GTC AAT GTC CAT GCC CC－3′（nt 1915－1896）；反义引物 P3：5′－CGG GTC AAT GTC CAT GCC CT－3′（nt 1915－1896）（针对突变株），由上海英骏生物技术有限公司合成。设计PCR终产物247bp。

1.2 方法

1.2.1 标本选取 用广州达安基因公司HBV DNA荧光定量PCR试剂盒检测的HBV DNA含量高于1×104IU／mL血清标本。HBV DNA的提取方法参照文献［6］。

1.2.2 PCR扩增 每个标本同时做2个扩增管，一管加P1、P2（5μmol／L）各1μL，另一管加P1、P3（5μmol／L）各1μL，其余所加成分相同，10×缓冲液2μL，dNTP（10mmol／L）0.4 μL，Taq DNA 酶（1U／μL）0.5μL，MgCl2（25mmol／L）0.4 μL，模板2μL，ddH2O 12.7μL，总体积20μL，95℃5min。然后94℃0.5min，58 ℃ 0.5min，72 ℃ 0.5min共循环35次，72℃延伸5min。

1.2.3 PCR产物上电泳 取PCR产物在1.2%琼脂凝胶（含EB）上电泳，观察结果。

1.2.4 PCR产物测序 用试剂盒分别回收和纯化各一管变异株、野生株PCR产物，送上海英骏生物技术有限公司测序。

2 结 果

2.1 标本扩增结果 PCR产物电泳结果见图1。设计产物长247bp，电泳结果与预期一致。本次实验共检测40个标本，有11个标本只检测到野生株，8个标本只检测到变异株，其余21个标本都是变异株与野生株混合感染。

图1 PCR产物电泳结果

2.2 PCR产物测序结果

2.2.1 野生株PCR产物序列 GAC TCG CAG CAA TGT CAA CGA CCG ACC TTG AGG CAT ACT TCA AAG ACT GTT TGT TTA AGG ACT GGG AGG AGT TGG GGG AGG AGA TTA GGT TAA AGG TCT TTG TAC TGG GAG GCT GTA GGC ATA AAT TGG TCT GTT CAC CAG CAC CAT GCA ACT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CAT CTC ATG TTC ATG TCC TAC TGT TCA AGC CTC CAA GCT GTG CCT TGG GTG GCT TTG GGG CAT GGA CAT TGA CCC G，序列中粗体字G为野生株1896位点。

2.2.2 变异株PCR产物序列 GAC TCG CAG CAA TGT CAA CGA CCG ACC TTG AGG CAT ACT TCA AAG ACT GTT TGT TTA AGG ACT GGG AGG AGT TGG GGG AGG AGA TTA GGT TAA AGG TCT TTG TAC TGG GAG GCT GTA GGC ATA AAT TGG TCT GTT CAC CAG CAC CAT GCA ACT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CAT CTC ATG TTC ATG TCC TAC TGT TCA AGC CTC CAA GCT GTG CCT TGG GTG GCT TTA GGG CAT GGA CAT TGA CCC G，序列中粗体字A为变异株1896位点。

3 讨 论

前C区是HBV基因组的高变区，前C区最常见的变异为G1896A，使第28位密码子TGG→TAG（终止子），翻译提前终止，导致HBeAg阴转。一方面血液中的HBeAg可以干扰或抑制CTL对肝细胞膜上的HBcAg的攻击，故HBeAg的减少可使CTL对肝细胞膜上的HBcAg攻击得更为强烈，从而引起严重的肝损害，导致重症肝炎。另一方面HBeAg阴转时，影响干扰素对HBV的疗效。

由于干扰素对乙型肝炎病毒患者抗病毒治疗疗程长、存在不良反应、患者花费大，因而治疗前需对患者进行评估。HBeAg阴性患者，可用中药方剂抗病毒治疗［7］。干扰素治疗对象主要是HBeAg阳性患者。在HBV感染者体内，常形成以一个优势株为主的相关突变株病毒群，称为准种（quasispecies）［8－9］，即变异株与野生株的混合感染。在 HBeAg阳性患者体内有些是G1896A点突变株和G1896野生株的混合感染，干扰素对G1896野生株有较好的疗效，而对G1896A点突变株疗效不好，对这类患者用干扰素治疗体内会出现G1896A点突变株成为优势感染株，达不到抗病毒治疗的效果，因而在干扰素治疗前对患者是否为G1896A点突变株和G1896野生株的混合感染进行检测具有重要的临床意义。如果单纯是G1896野生株感染，可直接用干扰素治疗。如果是G1896A点突变株和G1896野生株的混合感染，可用中药方剂和干扰素进行中西医结合抗病毒治疗。在治疗用药中和用药后检测，有利于疗效和预后的判断。目前一些常用方法［10－11］对前C区1896位点变异株与野生株的混合感染易漏检，本法能同时检测前C区1896位点变异株与野生株混合感染，PCR产物测序也证实了本法的特异性，且简单易行，成本较低，具有一定的应用价值。

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