携带人金属蛋白酶组织抑制剂1重组腺病毒的构建及在人脐静脉内皮细胞中的表达＊

李 汇，毛用敏，赵莉莉，崔让庄，王佩显

（1.天津医科大学 300070；2.天津市胸科医院 300051）

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分的主要酶系［1］，金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）是MMPs的内源性特异性抑制剂［2］。近年研究发现，MMPs／TIMPs的比例失衡与动脉粥样硬化、冠状动脉介入术后再狭窄以及心脏重塑等病理过程密切相关［3］。以腺病毒（adenovirus，AdV）为载体介导TIMP1到靶细胞，调节ECM的生成和降解，从而调节粥样斑块的稳定性可能成为冠心病基因治疗的新方法［4］。本研究构建携带人基质金属蛋白酶组织抑制剂因子1（human tissue inhibitor of matrix melall oprolease－1，hTIMP1）基因片段的重组腺病毒 Ad－hTIMP1［5］，并成功感染体外培养的人脐静脉内皮细胞CRL－1730，从而为进一步的在体实验提供平台，为基因治疗动脉粥样硬化，稳定粥样斑块提供靶基因的线索。

1 材料与方法

1.1 材料 AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统（穿梭质粒pAd－Track－CMV和骨架质粒pAdEasy－1）以及包装细胞系人胚肾细胞（human embryonic kidney 293T，HEK293T）购自北京大学实验室；pUCm－T载体质粒，BJ 5183菌株、JM109菌株和DH5α菌株均为本实验室保存。TaqDNA聚合酶为本实验室提取保存，限制性内切酶BglⅡ、NotⅠ和DNA marker购自TakaRa生物工程（大连）有限公司，PacI购自NEB公司；T4 DNA连接酶、高纯度质粒柱式提取试剂盒和脂质体购自Invitrogen公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和 DMEM高糖培养液购自美国Gibco公司；PCR引物由上海生工公司合成。DNA测序由北京三博远志生物工程公司完成。

1.2 腺病毒重组质粒的构建

1.2.1 pUC－hTIMP1重组质粒的构建 Genebank中搜索人TIMP1序列，设计上游引物为：5′－AGA ACC CAC CAT GGC CCC CT－3′；下游引物为：5′－GAT TCA GGC TAT CTG GGA CCG－3′。从人心肌细胞中提取总RNA，反转录PCR（reverse transcription－PCR，RT－PCR）得到人 TIMP1的基因片段，连接到pUCm－T载体质粒中，转化入感受态JM109细胞，NcoI酶切鉴定正确后行二次转化入JM109进行扩增，测序正确后提质粒pUC－hTIMP1。

1.2.2 穿梭质粒 pAdTrack－CMV－hTIMP1的构建 分别用BglⅡ和NotⅠ双酶切pUC－hTIMP1和穿梭质粒pAdTrack－CMV并凝胶回收hTIMP1片段和开环质粒pAdTrack－CMV，连接后转化JM109感受态细胞，酶切鉴定正确后二次转化JM109扩增，PmeⅠ酶切使之线性化，命名为重组质粒pAdTrack－CMV－hTIMP1。

1.2.3 同 源 重 组 构 建 重 组 腺 病 毒 质 粒 pAdEasy－GFP－hTIMP1 电穿孔法（2 500V，5ms）将PemⅠ酶切线性化的pAdTrack－CMV－hTIMP1重组质粒和 pAdTrack－CMV（空载体阴性对照）分别转化到含有pAdEasy－1的电感受态BJ5183中，筛选后BamHI和PacⅠ酶切鉴定。选取重组正确的质粒（pAd－hTIMP1和pAd－Track）在DH5α菌中大量扩增，高纯度质粒柱式提取试剂盒提取质粒，PacⅠ酶切线性化后凝胶回收较大片段。

1.3 重组腺病毒在293T细胞中包装和扩增

1.3.1 阳离子脂质体法将重组腺病毒转染293T细胞进行包装 转染前1d，将2个60mm培养皿中HEK293T细胞调整为0.6×106个细胞／皿，转染当天应用脂质体lipofectamine 2000及Plus reagent将pAd－hTIMP1和pAd－Track转染到两皿中，24h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达，倒置相差显微镜下观察细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE）。于转染后第9天收集细胞，反复冻融法得到重组腺病毒Ad－hTIMP1和Ad－Track上清液。

1.3.2 包装好的重组腺病毒感染293T细胞进行扩增 取病毒上清液的1／3感染293T细胞，感染后第3天反复冻融法收集重组腺病毒上清液，反复感染4次于293T细胞中扩增病毒到所需滴度。

1.3.3 重组腺病毒的纯化和观察 CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒颗粒，采用OD260法测定腺病毒的滴度。并用透射电镜观察腺病毒形态。

1.4 腺病毒介导TIMP1在内皮细胞中的表达

1.4.1 分组 体外培养人脐静脉内皮细胞CRL－1730，将之分到6孔板中（2.4×105细胞／孔）。分为空白对照组、Track对照组和TIMP1实验组，每组4个复孔。Ad－Track感染Track对照组，Ad－hTIMP1感染TIMP1实验组。48h后观察并收集细胞。

1.4.2 RT－PCR法扩增细胞TIMP1基因片段，以GAPDH为内参照 采用UNIQ－10柱总RNA抽提试剂盒提取各组人脐静脉内皮细胞CRL－1730中的总RNA，反转录得到cDNA，PCR扩增TIMP1基因片段。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。以电泳条带的灰度代表mRNA含量，目的基因与内参电泳条带灰度比值反应目的基因的相对值。采用Gelpro3.1凝胶成像系统对结果进行分析。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计学数据分析，计量资料以表示。组间比较采用单因素方差分析和LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 pAdEasy－GFP－hTIMP1重组质粒 PacⅠ酶切鉴定 RTPCR法从人心肌细胞中扩增hTIMP1，可以得到637bp的特异带。在pAd－Track－CMV上有2个PacⅠ的酶切位点，将重组子切为一个大片段和一个约4.5kb的小片段（图1）。

图1 PacⅠ 酶切pAd－hTIMP1和pAd－Track重组质粒

图2 转染Ad－hTIMP1重组腺病毒

2.2 293T细胞中包装并扩增腺病毒 重组腺病毒转染293T细胞后，第4～5天荧光显微镜下可观察到GFP呈“彗星状”改变，感染293T细胞后第3天可以观察到典型的CPE（图2），纯化后OD260法测得重组腺病毒 Ad－hTIMP1的滴度为1.9×1012v.p／mL，对照重组腺病毒pAd－Track的滴度为0.6×1012v.p／mL。透射电镜下见病毒颗粒直径约90nm，呈多面体形状，绝大多数病毒颗粒完整（图3）。腺病毒裂解液TIMP1 PCR，2%琼脂糖凝胶电泳图（图4）。TIMP1实验组内皮细胞TIMP1mRNA的表达（1.062±0.083）明显高于空白对照组（0.449±0.128）和Track对照组（0.365±0.164），P＜0.05，见图5。重组腺病毒感染体外培养的人脐静脉内皮细胞人脐静脉内皮细胞CRL－1730（图6）。

图3 Ad－hTIMP1病毒颗粒透射电镜图

图4 腺病毒裂解液TIMP1PCR扩增片段（可见637bp的特异条带）

图5 3组TIMP1 2%琼脂糖凝胶水平电泳图

图6 重组腺病毒感染体外培养的人脐静脉内皮细胞人脐静脉内皮细胞CRL－1730荧光表达情况（倒置荧光显微镜）

3 讨 论

MMPs是一类以Zn2＋为辅助因子的蛋白水解酶家族，在体内主要降解ECM。既往研究表明，AS斑块损伤部位MMPs表达升高，包括属于间质胶原酶的 MMP1、属于明胶酶的MMP2和MMP9，以及属于基质降解酶的 MMP3，而TIMP1和 TIMP2等表达减少［6－7］。Galis等［8］在冠状 AS中检测到MMPs与TIMPs的比例失调，认为调节两者之间的比例可起到治疗AS的作用。

Rouis等［9］报道腺病毒介导TIMP1过表达可以减轻ApoE－／－小鼠的颈动脉粥样硬化损伤程度，并推测此作用是由于TIMP1抑制MMPs活性保护了细胞外基质，进而抑制了平滑肌细胞的移行所致。该研究中，小鼠喂食6周高胆固醇饮食后注射携带TIMP1的重组腺病毒，4周后加以评估。发现动脉粥样硬化斑块的损伤面积明显减小。这与之前研究小鼠转基因过表达人TIMP1抑制 MMPs表达的结果相一致［10－11］。另外，转染携带TIMP1的重组腺病毒（Ad.TIMP1）使猪主动脉内皮细胞过表达TIMP1，可以减少细胞移行及对细胞外基质的侵袭［12］。随着分子生物学技术的进步，利用分子生物学技术使局部TIMP1过表达，为人们治疗AS带来希望［13］。

本研究采用He等［5］于1998年建立的技术方案，成功地进行了携带人TIMP1的重组腺病毒的构建，并采用Zeng等［14］报道的两步转化法，即将pAdEsay－1质粒先转化入BJ5183大肠埃希菌，并制备其电转化感受态细胞，再利用电转化仪将pAd－Track－CMV转入该菌，进而与细胞内的pAdEsay－1进行同源重组。这种方法与一步转化法相比，可以大大提高同源重组的效率，缩短实验时间［15］。

本研究发现，重组Ad－hTIMP1可以成功感染内皮细胞使实验组细胞内TIMP1过表达。为TIMP1作为靶基因用于稳定动脉粥样斑块的基因治疗奠定了基础。

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