不同填料固相小柱对多烯紫杉醇血浆样品萃取回收率的影响

王 杰 ，余 瑜

（重庆医科大学药学院 400016）

多烯紫杉醇（docetaxe1）为一类半合成的紫杉醇类抗肿瘤药，它作用于细胞微管蛋白，抑制细胞有丝分裂而发挥抗肿瘤作用，是现有药物中治疗转移性乳腺癌（MBC）和非小细胞肺癌（NSCLC）最有效的单剂化疗药物［1］。目前，有关多烯紫杉醇及其相关制剂在生物体内的药代动力学研究已经在国内外得到了较为广泛的开展［2－5］。本实验采用固相萃取法（SPE），选择不同的固相填料，对多烯紫杉醇血浆样品进行前处理研究，考察最适合的固相萃取条件。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；GL－88B型旋涡混合器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；PB602－E电子分析天平（瑞士梅特勒－托利多上海公司）；DCY－16S型氮吹仪（青岛海科仪器有限公司）；TGL－16G台式高速离心剂（上海安亭科学仪器厂）；Waters Oasis HLB柱（美国 Waters公司），Sep－pak vac c18小柱（美国Waters公司），Strata小柱（美国Phenomenex公司）。

多烯紫杉醇购自中国药品生物制品检定所（批号：10666－201002，纯度大于或等于99.5%），紫杉醇购自中国药品生物制品检定所（批号：10382－200301，纯度大于或等于99.5%），甲醇、乙腈为分析级色谱纯（阿达玛斯公司），实验用水为高纯水。

1.2 色谱条件 Phenomenex LUNA C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm，广州菲罗门科学仪器有限公司）；流动相为甲醇－乙腈－水（42∶26∶32，v／v／v）；流速：1.0mL／min；检测波长：230nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

1.3 固相萃取小柱洗脱条件考察

1.3.1 溶液的配制 分别取多烯紫杉醇对照品及内标紫杉醇适量，精密称定，用流动相稀释成浓度均为0.1g／L的多烯紫杉醇对照液及紫杉醇内标溶；空白人血浆稀释成多烯紫杉醇和内标紫杉醇浓度分别为0.05g／L和0.02g／L的样品液；另外采用纯甲醇和高纯水分别配制成浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70% 、80%及 90% 的 甲 醇 溶 液 。

1.3.2 血浆样品的固相萃取 将Waters Oasis HLB小柱用1 mL甲醇活化，1mL水平衡，加入1.3.1项下的样品液1mL，用水分别预洗3次（A1～A3），每次1mL，弃去预洗液，再用1 mL乙腈洗脱（A4）；另取 Waters Oasis HLB小柱10支，分别用1mL甲醇活化，1mL水平衡，加入上述样品液1mL，分别用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇各2mL进行洗脱（B1～B10），洗脱液用40℃氮气吹干，1mL流动相重新溶解后0.45μm微孔滤膜过滤。分别取20μL按上述HPLC色谱条件进样分析。

1.4 不同填料固相小柱的萃取效率 取1.3.1项制备的多烯紫杉醇对照品溶液和内标溶液，用空白人血浆稀释成多烯紫杉醇低、中、高浓度分别为0.1、1.0、10.0μg／mL的血浆样品溶液（内标紫杉醇浓度均为1μg／mL），每个浓度5份，用水稀释1倍，作为样品液。对 Waters Oasis HLB小柱，Waters Seppak vac C18小柱及Strata C18－E小柱进行比较。分别用1mL甲醇活化上述固相小柱，1mL水平衡，加入多烯紫杉醇血浆样品液，分别用1mL水预洗3次，弃去预洗液，2mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹干，适量流动相重新溶解，0.45μm微孔滤膜过滤。取20μL按上述高效液相色谱法（HPLC）条件进行分析，得多烯紫杉醇与内标紫杉醇峰面积比为A1。

另取1mL高纯水代替人血浆配制低、中、高3个浓度为0.1、1.0、10.0μg／mL的多烯紫杉醇对照品溶液（内标紫杉醇浓度均为1μg／mL），不经萃取，按上述HPLC色谱条件进样20μL分析，得多烯紫杉醇与内标紫杉醇峰面积比为A2，按下式计算：回收率（%）＝（A1／A2）×100%。

2 结 果

2.1 血浆样品固相萃取洗脱条件考察 采用 Waters Oasis HLB小柱为固相填料，以不同浓度的甲醇以及纯乙腈作为洗脱剂时，结果见表1。从表1可知，采用Waters Oasis HLB小柱为固相填料，最大可用甲醇清洗的浓度为60%，而最小洗脱浓度为80%，乙腈的洗脱能力与甲醇相差不大。考虑价格因素，故以纯甲醇进行洗脱。

表1 多烯紫杉醇和内标紫杉醇的清洗洗脱比较

图1 空白血浆HPLC色谱图

2.2 不同填料固相小柱的萃取效率 不同填料固相小柱对多西紫杉醇的萃取回收率见表2，HPLC色谱图见图1和图2。由表2可知，当以Waters Oasis HLB小柱为固相填料进行多烯紫杉醇的血浆样品萃取时，萃取回收率在95%～105%，RSD平均值为4.26%，适合用于血浆中多烯紫杉醇的测定。使用该小柱的回收率和精密度均高于另外2种固相小柱。

表2 不同填料固相小柱的萃取回收率（%，n＝5）

图2 空白血浆加多烯紫杉醇和内标HPLC色谱图

3 讨 论

血浆由于含有胆红素而呈淡黄色液体，是血液的重要组成部分；血浆的化学成分中，水分占90%～92%，其他10%以溶质血浆蛋白为主，并含有电解质、营养素、酶类、激素类、胆固醇和其他重要组成部分。多烯紫杉醇为白色结晶性粉末，易溶于有机溶剂。多烯紫杉醇血浆样品的前处理是体内药物分析工作的关键步骤，直接影响整个测定的准确性［6－7］。样品预处理技术——固相萃取是由液固萃取和柱液相色谱技术相结合，主要用于样品的分离、纯化和浓缩；与液－液萃取法相比，可以更有效地分离分析物与干扰组分，减少样品预处理过程，从而分析物的回收率［8－9］。固相萃取技术建立在液－固相色谱理论，采用选择性吸附和洗脱的方式对样品进行富集、分离和纯化，利用选择性吸附与洗脱的分离原理［10－11］。常用方法先让液体样品通过吸附剂（保留其中被测物质），之后选用适当强度溶剂除去杂质，最后用少量溶剂洗脱出被测物质，达到快速分离净化与浓缩的目的［12－13］。固相萃取作为样品前处理技术，在实验室中得到了越来越广泛的应用［14－15］。

固相萃取主要分为3类：正相固相萃取、反相固相萃取和离子交换固相萃取。正相固相萃取所用的吸附剂都是极性的，主要取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间相互作用，其中包括了氢键和π－π键的相互作用、偶极－偶极相互作用和偶极－诱导偶极相互作用以及其他的极性－极性作用；反相固相萃取所用的吸附剂和目标化合物通常是非极性的或极性较弱的，主要是靠范德华力或色散力（非极性－非极性相互作用）；离子交换固相萃取是靠目标化合物与吸附剂之间的相互作用是静电吸引力。Waters Oasis HLB小柱的填料是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N－乙烯基吡咯烷酮2种单体按一定比例聚合成而成，吸附容量高，批次间重现性好；美国Phenomenex公司的Strata C18－E小柱的填料是高度疏水的十八烷基键合硅胶基质端基封尾键合相；美国waters sep－pak vac C18小柱的填料是十八烷基键合硅胶。HLB小柱的另一优点是柱床干涸对提取影响不大，而另2种小柱在样品上样前，柱床不能干涸，否则需重新活化。

本研究表明，使用 Waters Oasis HLB小柱为固相填料进行多烯紫杉醇的血浆样品萃取，比使用其他2种填料更加适合用于血浆中多烯紫杉醇的测定。

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