人参总甙对 H2O2诱导的大鼠白内障的抑制作用相关实验研究

杨 宁,王 丽

(佳木斯大学附属第一医院眼科,黑龙江 佳木斯 154003)

老化、外伤、遗传、代谢异常、辐射、中毒和局部营养不良等因素是引起晶状体囊膜损伤的罪魁祸首,使其渗透性增加,从而失去屏障作用,或导致晶状体代谢紊乱,使晶状体蛋白发生变性,形成混浊逐步发展成为白内障。自由基引起的晶状体氧化损伤及生化改变是对晶状体产生损伤的主要机制。目前报道有抗氧化作用的中药有人参、三七、黄芪、灵子等。国内研究显示人参的乙酸乙酯及水提取物抗氧化活性较高,研究显示抗氧化活性为中等及中等极性化合物。人参总皂甙是从五加科植物人参的根、茎叶中提取精制而成。体外实验显示人参皂甙可以明显抑制脑和肝中过氧化脂质形成,减少大脑皮层和肝中脂褐素的含量,同时也能增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶在血液中的含量,具有抗氧化作用。本实验主要探讨人参总皂甙对过氧化氢诱导的大鼠白内障的预防作用,为以后预防白内障新药的系列开发奠定一定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:清洁级 SD大鼠15只,雌雄各半,体重(18±2)g,购于哈尔滨中医药大学动物实验中心。大鼠饲养于隔离笼内(顶部有空气过滤膜),饮用水和饲料均经高压灭菌处理,寄养于佳木斯大学动物中心清洁级动物房内。

1.1.2 试剂与仪器

试剂盐酸川芎嗪注射液广州南国制药厂;30%H2O2溶液南昌市东湖青山试剂助剂厂;复方托吡卡胺滴眼液参天制药株式会社;人参总甙广东省惠州市东方科技有限公司;超净工作台苏州安泰空气技术有限公司;眼科显微手术器械苏州器械六厂;二氧化碳细胞培养箱丹东市医疗器械厂。

1.2 实验方法及步骤

1.2.1 大鼠的分组,模型准备、用药情况

准备健康大鼠共18只,可提高晶状体36个。首先使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳,瞳孔散大后置于裂隙灯显微镜下观察晶状体是否混浊,需取透明晶状体进行实验。将大鼠处死,摘除眼球,将眼球放入 75%酒精浸泡消毒,后放入含庆大霉素 320000U/L的灭菌 PBS中15min。在无菌工作台上,使用解剖显微镜从球后视乳头处剖开眼球,除去除晶状体的所有组织,剥离肌肉及韧带,用捞勺将晶状体取出放入盛有30mL RPMI-1640培养液的培养皿中。每培养皿放 3个晶状体,于36.8℃、5.0%二氧化碳、设定培养箱湿度为95%,预孵4h,因人为操作不当造成6个晶状体混浊已被去除。

1.2.2 实验分组情况与晶状体培养程度

参照王勇报道的实验方法(经过改进:将 Medium199培养液换为 RPM I-1640细胞培养基)将晶状体用取出,并未经过排列放入不同条件培养液中。1,2,3每组7个晶状体,4,5每组放入 6个晶状体,分组如下 (其中 H2O2组是模型组):空白对照组:RPM I-1640培养液30mL,含有青霉素注射液100U/mL、链霉素注射液 100U/mL H2O2组:对照组培养液除外,另外加入 30% 过氧化氢 1.0μL(H2O2终浓度为300.0 μmol/L),川芎嗪组:除 H2O2组各成分之外,另加盐酸川芎嗪30mL。

1.2.3 观察晶状体的混浊的程度及分级

在培养完成之后对晶状体逐一进行拍照。在浅色背景下安排一组宽度为0.5mL,距离2.5mL的深色线条呈交叉垂直状态,培养完成后将各组大鼠晶状体放入“+”字交叉的深色线条上面,通过观察透过晶状体显示出的线条清晰度,用这种方法进行分级。比较每个实验组间 /内的晶状体混浊的程度不同。

“-”:线条可见并清晰,为透明不混浊晶状体;计 0分;“+ ”混浊:线条模糊不清 ,但是轮廓大致可见;计 1.0分;“++”混浊:线条轮廓极不清楚,仅中央部分略微可以观察到;计 2.0分;“+++”混浊:线条完全不见,晶状体呈全部混浊,计 3.0分。

1.2.4 测定超氧化物歧化酶(SOD)

实验测定原理:通过黄嘌呤氧化酶及黄嘌呤二者反应产生超氧阴离子自由基,硝酸盐由前者氧化羟胺形成,在显色剂的条件下显现为紫红色。当测试样品中含有 SOD时,则对超氧阴离子自由基有唯一性的抑制功能,使亚硝酸盐形成逐渐减少,利用计算公式可计算出被测样品中的 SOD活力。用比色法测定 SOD活性,将测定管和对照管分别装入试剂一1.0mL和试剂二、试剂三、试剂四各 0.1mL,测定管加入样品0.1mL,对照管加入蒸馏水 0.1mL。用旋涡混匀器充分混匀,置37℃恒温水浴40min后对照管测定管各加入显色剂2mL,将各管混匀 ,室温放置 10min,于波长 550nm处,1cm光径比色杯,蒸馏水调零,比色测各管 OD值。

计算公式为:组织匀浆中 SOD活力(U/mgprot)=

1.3 统计学处理

采用 SPSS18.0软件以 P ＜0.05显示具有显著差异。

2 结果

在晶体抗氧化酶活方面人参总甙组高于空白对照组,而低于阳性对照组,具有显著差异 (P ＜0.05),见表1。

表1 培养24h后各组晶状体抗氧化酶活性 (±s,n=6)

表1 培养24h后各组晶状体抗氧化酶活性 (±s,n=6)

组 别 SOD活性空白组 38.12±1.86过氧化氢组 9.24±0.58人参总甙组 23.15±1.46

3 讨论

人参总甙对鼠白内障的发生、发展有一定的预防作用,应进一步深入研究。中医药创新研究是我国最具原始创新潜力的领域,近年来我国中药产业持续发展,已初步形成了一定规模的产业体系,成为我国国民经济极具发展优势和市场前景的战略性产业。人参素有“百草药”的美誉,在中医药领域已有两千对年的应用历史。目前在人参的创新研究过程中,关于人参抗氧化方面的研究有诸多报道。国内周才琼等[2]人的研究显示人参的乙酸乙酯及水提取物抗氧化活性较高,研究显示抗氧化活性为中等及中等极性化合物。例如有学者报道[3]人参可以抑制 SO2引发的肝脏的超氧化物歧化酶、过氧化物酶及过氧化氢酶下降和丙二醛的升高,对 SO2引发的肝脏损伤有一定的防护作用。马中春[4]等人的研究显示人参胶囊具有降低雄性老年大鼠血清中过氧化脂质 MDA含量、升高血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的作用,提示人参胶囊在抗氧化领域用很好的应用前景。张嘉麟[5]等人的研究显示小鼠红细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活力可以被人参总皂甙可以提高,说明人参总皂甙具有很强的抗氧化活性,在抗衰老方面有一定的应用价值。

[1]刘宏伟,刘远光.高温氧化条件下人晶状体上皮细胞内HSP70mRN A的表达 [J].黑龙江医药科学,2008,31(4):19

[2]ZHOU Cai-qiong,ZHANG Bao-yong.Study on anti-oxidation of Indian ginseng in vitro[J].Science and Technology of Food Industry,2008,02:4-8

[3]Ai Y,Zheng Z,O'Brien- Jenkins A,et al.A mouse model of galactose-induced cataracts[J].Hum Mol Genet,2000,22(12):1821-1827

[4]马中春.人参胶囊降低雄性老年大鼠血清中过氧化脂质 M DA含量、升高血清中谷胱甘肽过氧化物酶研究进展 [J].眼科新进展,2003,23(1):52-55

[5]张嘉麟.三七中人参皂甙对老年鼠血液中抗氧化酶活力影响的研究 [J].昆明医学院学报,2005,25(4):308-309