姜黄素和灵芝孢子对非酒精性脂肪性肝病ApoB100 mRNA的影响

梁衍锋,张东东,孙俐俐,倪 蕾,刘君星,王芳芳,房艳春,王淑秋,马小茹,刘 蕾,吴佳梅

(1.佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯 154007;2.大庆市油田总医院,黑龙江 大庆 163000;3.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯154003)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,N AFLD)是最常见的慢性肝脏疾病,以肝细胞脂肪变性和脂肪沉积为病理特征,无过量饮酒史、病毒感染或其它特定病原体的临床综合征[1,2]。N AFLD是一种遗传-环境-代谢应激相关性疾病[3],发病机制复杂。载脂蛋白 B(apolipoprotein B,ApoB)由肝脏合成 ,是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的主要结构蛋白,与 LDL关系密切 ,在 N AFLD的发生发展中起着重要的作用。

姜黄素(curcumin)和灵芝(ganoderma lucidum)均具有保肝护肝作用。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄中分离出来的一种具有β-二酮结构的多酚类化合物,其使用历史悠久[4]。灵芝是一种珍贵的药用真菌,具有多种药用价值。灵芝孢子为其发育后期弹射释放出的种子,其主要成分与灵芝相似,但其有效成分的种类和含量均高于灵芝子实体[5]。有报道显示[6]灵芝饱子能显著降低 D-氨基半乳糖所致小鼠血清ALT和 AST,并有效减轻甚至防止小鼠肝损伤;对注射四氯化碳引起的血清 ALT升高及肝脏甘油三脂的蓄积均有明显降低作用。本实验在姜黄素和灵芝孢子保肝护肝作用的基础上研究其对 NAFLD小鼠肝脏 ApoB100表达的影响,从基因水平探讨姜黄素及灵芝孢子治疗 N AFLD的机制,并对比两种药物的治疗效果。

1 材料和方法

1.1 材料

姜黄素,质量分数95%。灵芝孢子,由药物研究所提供。琼脂糖(美国 Sigma公司),引物、GAPDH、DEPC、RNA提取试剂盒(上海生物工程技术有限公司),TAKARA RNAiso Plus、Taq DN A聚合酶、DL1000DNA Marker、 TAKARA反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型及分组:将60只昆明种雄性小鼠适应性喂养3d后,随机分为4组(正常组、N AFLD模型组、姜黄素治疗组、灵芝孢子治疗组),正常组饲正常饮食,其它组饲自制高脂饮食(基础饲料80.5%,胆固醇 2%,猪油 7%,蛋黄粉 10%及胆盐0.5%)。4周后姜黄素治疗组强饲姜黄素生理盐水混浊液,灵芝孢子治疗组强饲灵芝孢子生理盐水混浊液,其它两组采用生理盐水代替。12周后取材,HE染色观察肝脏变化。

1.2.2 RT-PCR:RNA提取及反转录使用的所有器具均经酸浸过夜,冲净后 DEPC水浸泡过夜,高温高压灭菌后烤干密封保存备用。

(1)提取总 RN A并检测其质量:取肝组织加入适量RN Aiso Plus匀浆,12,000g 4℃离心 5min,取上清液加入氯仿振荡。12,000g 4℃离心15min。取上层水相加入等体积异丙醇,12,000g 4℃离心10min。弃上清,清洗 RN A沉淀。室温干燥后加入 RNase-free水溶解,确定 RNA纯度和浓度 ,琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性,-80℃保存。

(2)反转录:依据试剂反应体系对提取的 mRNA进行反转录,反转录后的 cDNA-20℃保存。

(3)PCR引物序列为:ApoB100基因 上游引物:5’-TCGAGCACAGATGACCAGAGT-3’,下 游 引 物:5’-CTTAGAAGCCTTGGGCACAT-3’扩增片断长度为201bp; GAPDH 上 游 引 物: 5’ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,下 游 引 物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’扩增片断长度为452bp。PCR产物琼脂糖电泳,凝胶成像系统观察并保存。

1.3 统计学处理

表1 4组动物肝脏组织 ApoB100 mRNA半定量分析结果 (±s,n=15)

表1 4组动物肝脏组织 ApoB100 mRNA半定量分析结果 (±s,n=15)

分组 ApoB100/GAPDH正常组 0.74±0.05 N AFLD模型组 0.96±0.05姜黄素治疗组 0.80±0.04灵芝孢子治疗组 0.83±0.01

图1 正常组、NAFLD模型组 ApoB100、GAPDH mRNA的 RT-PCR反应条带

图2 姜黄素治疗组 ApoB100、GAPDHmRNA的 RT-PCR反应条带

图3 灵芝孢子治疗组 ApoB100、GAPDH mRNA的 RT-PCR反应条带

2 结果

ApoB100 mRN A检测结果:如图 1、图 2、图 3所示 ,正常组、NAFLD模型组、姜黄素治疗组、灵芝孢子治疗组均可在201bp,452bp见 ApoB100及 GAPDH扩增产物条带,与实验设计的目的基因扩增产物长度吻合。扫描图像净光密度数值经过方差分析显示,动物肝脏组织 ApoB100mRN A在模型组表达增高,姜黄素治疗组和灵芝孢子治疗组表达均降低。经统计学分析正常组、模型组、姜黄素治疗组之间相比较差异有极显著性意义 (P＜0.01);组间两两比较差异均有统计学意义 (P ＜0.05)。正常组、模型组、灵芝孢子治疗组之间相比较差异有极显著性意义 (P＜0.01);组间两两比较差异均有统计学意义 (P＜0.05)。姜黄素治疗组与灵芝孢子治疗组比较差异无统计学意义 (P＞ 0.05)。

3 讨论

ApoB存在于低密度脂蛋白(LDL)表面,细胞识别和摄取 LDL主要通过识别 ApoB来实现[7]。ApoB由肝脏合成,是低密度脂蛋白胆固醇的主要结构蛋白,有 ApoB100和ApoB48两个类型 ,ApoB100与 LDL的关系更为密切[8]。本实验结果显示,N AFLD模型组与正常组比较,ApoB100 mRN A的表达显著增高,差异有显著性 (P ＜0.05)。说明N AFLD模型组肝脏中 ApoB100mRNA的表达明显增高,这可能与高脂饮食导致血脂增高有关。姜黄素治疗组和灵芝孢子治疗组与模型组相比较肝脏 ApoB100 mRNA表达均降低,但仍高于正常组,差异有显著性 (P ＜0.05)。说明应用姜黄素和灵芝孢子治疗 NAFLD均得到一定的效果,二者均可通过降低肝脏中 ApoB100 mRN A的表达调节小鼠肝脏脂代谢。姜黄素治疗组与灵芝孢子治疗组相比较肝脏 ApoB100 mRN A的表达差异无统计学意义,本实验结果显示姜黄素与灵芝孢子对于小鼠 NAFLD治疗效果无明显差异。

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[2]Giovanni Musso,Roberto Gambino,Maurizio Cassader.Recent insights into hepatic lipid metabolism in non-alcoholic fatty liv er disease(NAFLD)[J].Progress in Lipid Research,2009,48(1):1-26

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[4]梁衍锋,张东东,孙俐俐,等.姜黄素对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝脏 SREBP-1cmRNA表达的影响[J].黑龙江医药科学.2012,33(5):7-8

[5]唐力,邢继强,韩玉泽.不同产地灵芝中多糖含量的比较[J].黑龙江医药科学,1999,22(3):25

[6]赵红宇,李文斌,李洪源,等.破壁灵芝孢子粉对肝纤维化的影响研究 [J].黑龙江医药科学,2006,29(1):96

[7]王舒然,陈炳卿,王朝旭,等.灵芝孢子降血脂及抗氧化作用的研究 [J].中国公共卫生学报,1999,1(5):263-265

[8]刘殿峰,孙玉成,夏强,等.神经内分泌因子对体外培养肝细胞ApoB100 mRNA丰度的影响[J].中国生物制品学杂志,2008,21(11):957-960