广东省东莞地区发现1株泛耐药产KPC－2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌

张 丽，张小兵，杨维青，黄 娟，张丽华，张菊芬，朱学海，朱凯欣，周 静

肺炎克雷伯菌是医院感染的常见病原菌之一，其耐药的主要原因是细菌产生质粒介导的β内酰胺酶，主要是产超广谱β内酰胺酶和质粒AmpC酶，有些菌株2种酶同时存在，导致对多种抗菌药物耐药［1］。随着碳青霉烯类抗生素的大量使用，出现了对其耐药的肺炎克雷伯菌。国内报道临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌，其主要耐药机制是产KPC－2型碳青霉烯酶，以华东地区报道的较多［2］。日前，我院在1例ICU患者的痰液中分离到泛耐药产KPC－2β内酰胺酶的肺炎克雷伯菌，现报道如下。

材料与方法

一、材料

（一）菌株来源 中山大学附属东华医院ICU患者的痰标本中分离到1株肺炎克雷伯菌。质控菌株为大肠埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、产KPC－2型的质控菌2105（由复旦大学附属华山医院抗生素研究所胡付品博士惠赠）。

（二）主要仪器与试剂 VITEK2全自动细菌分析鉴定系统为法国生物梅里埃公司产品。药敏纸片亚胺培南（10μg）、美罗培南（10μg）、阿米卡星（30μg）、左氧氟沙星（5μg）、环丙沙星（5μg）、哌拉西林（100μg）、哌拉西林－他唑巴坦（100－10 μg）、氨曲南（30μg）、头孢他啶（30μg）、头孢曲松（30μg）、头孢吡肟（30μg）、头孢西丁（30μg）、甲氧苄啶－磺胺甲口恶唑（1.25－23.75μg）及药敏 MH培养基购自英国OXOID公司。PCR仪为美国ABI公司产品。DYY－6C型电泳仪、WD－9403C紫外仪为北京市六一仪器厂。细菌质粒提取试剂盒、PCR检测试剂盒均为大连宝生物科技有限公司 产 品。引 物［3］blakpcF5′－GCT ACA CCT AGC TCC ACC TTC－3′blakpc R5′－ACA GTG GTT GGT AAT CCA TGC－3′由生工生物工程（上海）有限公司合成。

二、方法

（一）菌株分离与鉴定 按常规方法从临床标本分离细菌，获纯培养后进行革兰染色和氧化酶试验，根据革兰染色和氧化酶结果选择革兰阴性鉴定卡，在VITEK2全自动微生物分析仪上进行菌种鉴定，操作严格按照说明书进行。

（二）药敏试验 选用K－B纸片琼脂扩散法，挑取一定量细菌配成0.5麦氏比浊的菌液，均匀涂布于MH平皿上，室温干燥3～5 min。贴细菌药敏纸片，各纸片中心大于24 mm，纸片距离平皿边缘应大于15 mm。置35℃孵育16～18 h后读取结果，参照 CLSI 2011年版标准判读［4］。

（三）耐药表型检测 采用改良的Hodge试验检测待检菌的耐药表型［4］。用大肠埃希菌ATCC 25922以生理盐水制备0.5麦氏标准菌悬液，按常规K－B法程序接种MH平皿，使平皿干燥5 min，在直径90 mm平皿中央放置亚胺培南（10μg）纸片1张。然后使用10μL接种环挑取在血平皿过夜生长的3～5个试验菌落，从纸片边缘向外划直线接种。划线至少25 mm长，孵育24 h后，检查 MH平皿，在抑菌环与试验菌株交叉处是否出现增强生长。

（四）模板制备与PCR扩增及测序 煮沸裂解法制备模板DNA，PCR筛选KPC－2基因，所用引物及方法参照文献［3］。PCR法扩增KPC－2基因的反应条件：预变性94℃5 min，变性94℃30 s，退火52℃30 s，延伸72℃1 min，共35个循环，再延伸72℃7 min，4℃保存10 min，即可电泳检验结果。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，将1μL的核酸染料（将原液用0.5×TBE电泳缓冲液稀释10倍）与5μL的Marker2000混匀取3μL加入凝胶孔中作参照；将1μL核酸染料、1μL的6×Loading buffer和4μL的PCR产物混匀取3μL上样。110 V电泳35 min，溴化乙靛染色15 min，洗脱后放凝胶成像系统成象，观察结果。以肺炎克雷伯菌ATCC700603作阴性对照，KPC－2阳性菌株2105作阳性对照。产物经纯化、胶回收后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果在GenBank网上查询比对。

结 果

一、细菌鉴定和药敏试验

经鉴定该菌为肺炎克雷伯菌，细菌鉴定可信度99%。药敏试验结果显示，除对阿米卡星敏感外，对亚胺培南 、美罗培南、哌拉西林－他唑巴坦和其他常用抗菌药物均耐药。

二、改良Hodge试验检测待检菌的耐药表型

大肠埃希菌（ATCC25922）抑菌环与痰标本分离到泛耐药肺炎克雷伯菌在交叉处出现增强生长，而对照菌株在交叉处未出现增强生长。见图1。

三、PCR扩增及测序

PCR产物GenBank Blast程序分析，该序列与KPC－2（GenBank11844849号）的核苷酸序列同源性为100%。PCR扩增检测到KPC－2基因，序列长度为920 bp。见图2。

图1 产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌Hodge试验结果Figure 1 Results of Hodge test for production of KPC－2 carbapenemase in Klebsiella pneumoniae

图2 PCR产物电泳结果Figure 2 Results of electrophoresis for PCR products

四、临床病史调查分析

该患者男性，52岁，因“鼻咽癌放疗后17年余，咳嗽2 d，高热1 d”入住我院ICU。入院诊断：①社区获得性肺炎（重症），急性呼吸衰竭；②血流感染（肺炎链球菌），脓毒性休克；③支气管扩张。入院后予以严密监测生命体征，积极抗感染治疗等处理，并行气管插管、机械通气治疗。曾用头孢他啶、哌拉西林－他唑巴坦、左氧氟沙星、亚胺培南等抗菌药物。2012年3月8日，痰培养示泛耐药肺炎克雷伯菌，予替加环素和阿米卡星抗感染，停用呼吸机，入住隔离病房，加强支持治疗后，1个月内2次痰培养均未检出肺炎克雷伯菌。

讨 论

碳青霉烯类抗生素对革兰阴性菌的抗菌谱广，抗菌活性强，是治疗医院严重感染常用药，尤其适用于产超广谱β内酰胺酶或AmpC酶肠杆菌科细菌的严重感染。随着碳青霉烯类抗生素在临床上广泛使用，出现了耐药菌株。目前，引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的最常见原因是碳青霉烯酶的产生，尤其以产KPC酶最为常见。KPC酶最早在1株亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌中发现，是一种新型碳青霉烯酶，属于Bush分类的A组2f亚组丝氨酸酶。此类酶能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素，克拉维酸对酶活性作用不确定［3］。目前发现11个KPC亚型，并在美国，特别是美国东北部各州蔓延，造成局部暴发和流行［5］；在我国，产 KPC－2酶的细菌以华东地区报道较多［2］。回顾东莞地区以往的耐药监测数据，未发现耐碳青霉烯类的肠杆菌科细菌［6－7］。此次发现的1株耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌经过PCR检测，其耐药基因及测序发现为产KPC－2型碳青霉烯酶，与我国其他地区报道的型别相同［2］。

碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌往往对临床常用的抗菌药物呈现耐药。胡付品等［2］报道的中国CHINET2010年监测数据显示，碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌除对阿米卡星和米诺环素的耐药率分别为52.6%和37.0%外，对其他抗菌药物的耐药率均在70.0%～100%。Hirsch等［8］报道，治疗由碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌引起的感染，可选用氨基糖苷类联合黏菌素或替加环素的治疗方案。本研究发现，该肺炎克雷伯菌除对阿米卡星敏感外，对其他测试抗菌药物均耐药。临床根据药敏结果改用替加环素联合阿米卡星，并拔除气管插管及对症处理后，病情好转，且1个月内连续2次痰培养均未检出肺炎克雷伯菌。

Patel等［9］的研究表明，患者免疫状态、入住ICU、长期住院以及广谱抗菌药物的应用是导致医院内碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌感染或定植的危险因素。本次是在1例入住ICU，免疫功能低下的鼻咽癌化疗患者中分离出该菌株，临床依据实验室结果合理应用抗生素及对症治疗后，细菌培养转阴，也未引起医院内播散。

因此，临床依据药敏结果合理使用抗菌药物、加强医院感染控制措施，可遏制耐药菌株的产生和播散。

［1］ 胡付品，叶信予，吴培澄，等.2005年上海华山医院细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2007，7（4）：332－337.

［2］ 胡付品，朱德妹，汪复，等.CHINET监测2010年碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌的分布特点和药物敏感性［J］.中国感染与化疗杂志，2013，13（1）：1－7.

［3］ Smith Moland E，Hanson ND，Herrera VL，et al.Plasmid－mediated，carbapnem－hydrolysingβ－lactamase，KPC－2，in Klebsiella pneumoniaeisolates［J］.J Antimicrob Chemother，2003，51（3）：711－714.

［4］ Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing［S］.Twentieth Informational Supplement，2011，M100-S21.

［5］ Woodford N，Tierno PM Jr，Young K，et al.Outbreak ofKlebsiella pneumoniae producing a new carbapenem—hydrolyzing class A beta－lactamase，KPC－3，in a New York Medical Center［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48（12）：4793－4799.

［6］ 张丽华，张丽，李超强，等.东莞东华医院2007年细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2008，8（5）：379－382.

［7］ 张丽，张丽华，张小兵.2009年中山大学附属东华医院细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2011，11（5）：375－380.

［8］ Hirsch EB，Tam VH.Detection and treatment options for Klebsiella pneumoniae carbapenemases（KPCs）：an emerging cause of multidrug－resistant infection［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65（6）：1119－1125.

［9］ Patel G，Huprikar S，Factor SH，et al.Outcomes of carbapenem－resistant Klebsiella pneumoniae infection and the impact of antimicrobial and adjunctive therapies［J］.Infect Control Hosp Epidemiol，2008，29（12）：1099－1106.