山茱萸多糖对阿尔茨海默病模型大鼠tau蛋白的影响

姚海涛 马金丽 张晓波 王 涛 王淑秋

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

阿尔茨海默病(AD)是最常见的一种神经退行性病变，其标志性病理改变是细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积导致老年斑形成和神经元纤维缠结(NFTs)。神经系统内的tau蛋白异常磷酸化是这两种病理改变的主要原因，在AD的发病机制中占有重要的地位。本实验观察山茱萸多糖对AD大鼠海马神经元tau蛋白在Ser422位点、Ser396位点磷酸化水平的影响，探讨其对AD大鼠神经元保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 健康Wistar大鼠63只，购于大连医科大学实验动物中心，其中青年组12只，体重(179±20)g;51只大鼠体重(225±25)g，随机分为假手术组10只、AD模型组14只、多奈哌齐组14只、山茱萸多糖组13只。饲养室温为20℃，自由进食饮水，自然昼夜节律光照。

1.2 药物和试剂 山茱萸多糖购自宁波德康生物制品有限公司(批号20120110);Aβ1～40购自上海瑞奇生物科技有限公司(批号RS130310);盐酸多奈哌齐购自济南德信佳生物科技有限公司(批号12072701);兔抗鼠p-tau(Ser422)和兔抗鼠p-tau(Ser396)购自北京博奥森生物技术有限公司;tau抗体和其他试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 动物处理及给药 按照60 mg/kg给大鼠连续腹腔注射D-半乳糖6 w，之后将AD模型组、多奈哌齐组、山茱萸多糖组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于脑立体定位仪上，依《大鼠脑立体定位图谱》〔1〕向海马注入凝聚态 Aβ1～401 μl，5 min内注完，留针10 min后缝合皮肤待苏醒;假手术组注入等量无菌生理盐水;7 d后，多奈哌齐组每日以0.5 mg/kg灌胃，山茱萸多糖组每日以0.175 g/kg灌胃，假手术组和模型组以等量生理盐水灌胃，1次/d，连续30 d。

1.4 指标的检测方法 采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力;大鼠海马p-tau(Ser422)、tau的表达采用免疫组化法，胞质内呈现棕黄色颗粒为阳性表达，图像采集后使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算出图像中阳性染色的平均光密度值。大鼠海马p-tau(Ser422)和p-tau(Ser396)表达采用Western印迹法检测，使用Tanon GIS4.0凝胶图像分析系统进行分析，其结果以相对光密度值表示。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行分析，数据结果以x±s表示，如数据资料符合正态分布且方差齐，组间比较采用q检验，采用单因素方差分析、F检验;如数据资料不符合正态分布或方差不齐，采用秩和检验。

2 结果

2.1 山茱萸多糖对各组大鼠学习记忆能力的影响 与青年组比较，手术前和手术后大鼠逃避潜伏期均明显延长(P＜0.01)，手术造模后大鼠的潜伏期也明显长于手术前(P＜0.01)，且进行Aβ注射前各组大鼠逃避潜伏期与假手术组之间无明显差异(P＞0.05)。AD模型组、多奈哌齐组和多糖组在造模后潜伏期无明显差异(P＞0.05);与AD模型组比较，多奈哌齐组和多糖组在给药30 d后逃避潜伏期明显缩短(P＜0.01)。假手术组、模型组、阳性对照组、多糖组大鼠跨越平台次数较青年组明显减少(P＜0.05);AD模型组、多奈哌齐组和多糖组大鼠跨越平台次数和游程比组间无显著差别(P＞0.05)，且均显著少于手术前(P＜0.01)，而且较假手术组均有显著差异(P＜0.01)，组间比较结果显示在手术前各组间无显著差别;多奈哌齐和多糖均能显著提高跨越平台次数和游程比(P＜0.01)，但两组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1～表3。

2.2 山茱萸多糖对各组大鼠海马p-tau(Ser422)，tau表达的影响 与青年组和假手术组比较，模型组大鼠海马CA3区tau蛋白阳性染色减弱(P＜0.05)，而 p-tau(Ser422)蛋白阳性染色明显增强(P＜0.01);与模型组比较，多奈哌齐和山茱萸多糖ptau(Ser422)蛋白阳性染色均明显减弱(P＜0.05)，而tau蛋白阳性染色均显著增强，差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)，多奈哌齐组和山茱萸多糖组之间无明显差别(P＞0.05)。见表4，图1，图2。

2.3 山茱萸多糖对各组大鼠p-tau(Ser396)和p-tau(Ser422)表达的影响 模型组大鼠海马CA3区p-tau(Ser396)和p-tau(Ser422)蛋白阳性染色较青年组和假手术组明显增强(P＜0.01，P＜0.05);与模型组比较，多奈哌齐和山茱萸多糖可明显降低 p-tau(Ser396)蛋白阳性染色(均 P＜0.05)和 p-tau(Ser422)蛋白阳性染色(P＜0.05)，而多奈哌齐组与山茱萸多糖组比较无明显差别(P＞0.05)。见表5，图3。

表1 山茱萸多糖对各组大鼠游程比的影响(x±s)

图1 tau蛋白在大鼠海马CA3区免疫组化检测结果(×400)

图2 大鼠海马CA3区p-tau(Ser422)蛋白免疫组化结果(×400)

表2 山茱萸多糖对各组大鼠逃避潜伏期的影响(x ± s，s)

表3 山茱萸多糖对各组大鼠跨越平台次数的影响(x±s)

表4 tau-2与p-tau(Ser422)蛋白在大鼠海马CA3区的表达(x ± s，AOD)

表5 p-tau(Ser396)与p-tau(Ser422)在各组大鼠海马的表达(x ± s，OD)

图3 各组大鼠p-tau(Ser396)与p-tau(Ser422)在大鼠海马区的免疫印迹表达

3 讨论

Tau是一种分布于神经元胞质和轴突内的微管相关蛋白，具有促进微管蛋白聚集和维持微管结构的功能。在AD的起病与发展过程中，tau蛋白过度磷酸化可能是十分关键的核心环节，由于tau蛋白的过度磷酸化使其具有了神经毒性〔2，3〕。研究已证明，过度磷酸化的tau是NFTs神经纤维缠结形成的主要成分〔4〕，本实验发现山茱萸多糖和多奈哌齐可明显改善AD模型大鼠的学习记忆能力。AD模型组大鼠海马非磷酸化tau蛋白明显少于对照组，而磷酸化的tau蛋白水平增加。在山茱萸多糖治疗后的AD模型大鼠海马内的tau蛋白有所提高，同时磷酸化水平明显下降。tau蛋白的磷酸化位点共有45个，其中超过30个磷酸化位点位于Thr或Ser残基〔5〕。一些研究发现在成年人脑中除Ser404位点外，Ser202、Ser396两位点不发生磷酸化;但在 AD 患者 Ser202、Ser396、Ser404 以及 Ser235、Ser262、Ser422、Thr181、Thr231等很多位点均可发生磷酸化〔6〕。目前，很多学者认为 Ser396、Ser422、Thr181、Thr231、Ser404 等磷酸化位点是轻度认知功能障碍向AD过渡的可靠预报器〔7〕。本研究观察到正常大鼠海马中Ser396和Ser422位点有轻度磷酸化表达，而模型组表达量明显增高，经过山茱萸多糖和多奈哌齐干预后，其表达量下降，说明山茱萸多糖和多奈哌齐均能调解这两个磷酸化位点影响AD模型大鼠海马中tau的磷酸化水平，但两用药组比较未见明显差别。有学者研究发现山茱萸及其多糖具有多种药理作用〔8，9〕。本研究发现山茱萸多糖参与调节AD大鼠海马tau蛋白磷酸化过程，改善AD大鼠的病理发展程度。但由于AD发生和进程的多环节、多层系性，以及对tau蛋白磷酸化调解的复杂性，山茱萸多糖调节tau蛋白磷酸化机制尚未十分明确，仍需更广泛和深入的研究。

1 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.北京:人民卫生出版社，1991:44-5.

2 Mocanu MM，Nissen A，Eckermann K，et al.The potential forβ-structure in the repeat domain of tau protein determines aggregation，synaptic decay，neuronal loss，and coassembly with endogenous Tau in inducible mouse models of tauopathy〔J〕.JNeurosci，2008;28(3):737-48.

3 Steinhilb ML，Dias Santagata D，Fulga TA，et al.Tau phosphorylation sites work in concert to promote neurotoxicity in vivo〔J〕.Mol Biol Cell，2007;18(12):5060-8.

4 Gong CX，Liu F，Grundke-Iqbal I，et al.Post translational modifications of tau protein in Alzheimer's disease〔J〕.J Neural Transm，2005;112(6):813-38.

5 Kurko D，Boros A，Dezso P，et al.Flow cytometry-based method to analyze the change in Tau phosphorylation in a hGSK-3beta and h Tau over-expressing EcR-293 cell line〔J〕.Neurochem Int，2006;48(5):374-82.

6 Hasegawa M，Morishima-Kawashima M，Takio K，et al.Protein sequence and mass spectromet-ric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain〔J〕.JBiol Chem，1992;267(24):17047-54.

7 Diniz BS，Pinto Júnior JA，Forlenza OV.Do CSF total tau，phosphorylated tau，and β-amyloid 42 help to predict progression of mild cognitive impair-ment to Alzheimer's disease?A systematic review and meta-analysis of the literature〔J〕.World JBiol Psychiatry，2008;9(3):172-82.

8 王明富，欧 芹，朱贵明，等.山茱萸纳米水提液对衰老小鼠脑组织p66shc表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(9):1249-50.

9 金 红，欧 芹，王迪迪，等.山茱萸多糖对衰老模型大鼠学习记忆能力影响的研究〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(12):1467-9.