大鼠骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞诱导分化的机制

邸 军 李梓菲 陈 艳 高 丹 张 蕾

(吉林省人民医院病理科，吉林 长春 130021)

长期供氧供能不足会导致心肌细胞(MC)损伤及死亡，从而造成MC数量减少，进一步导致疤痕组织形成和心室重构，引起心脏功能受损甚至危害生命。目前的研究普遍认同MC是终末分化期永久细胞，不具有自我增殖的能力，受到损伤后细胞无法通过自身的增殖代替死亡细胞达到修复心肌的目的。近些年来细胞疗法即利用细胞移植替代器官组织中损伤或死亡细胞的方法已经成为目前医学研究领域的一个重点研究方向。骨髓间充质干细胞(BMSCs)的自我更新能力和多分化潜能使其成为细胞疗法的重要种子细胞〔1，2〕。BMSCs在适当的条件下可以诱导分化为多种类型的细胞〔3～5〕。目前已经有实验证明BMSCs可以在一定诱导条件下分化为MC，但是其具体机制并未完全阐明。本实验试图阐明其分化机制，为BMSCs在心血管疾病的治疗应用上探索新的方法。

1 材料与方法

1.1 BMSCs的分离培养及体外扩增 无菌条件下分离大鼠乳鼠双下肢股骨，应用PBS冲洗多次。将含10%FBS的L-DMEM完全培养基吸入含有肝素的注射器内，冲洗骨髓腔3～4次。将冲洗获得的细胞悬液加入到含10%胎牛血清的L-DMEM完全培养液内，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入培养基，调整细胞数，以1×106cells/ml密度接种于培养瓶中，置37℃ 含有5%CO2培养箱进行培养，每3 d全量换液1次。待贴壁细胞生长达到80% ～90%融合后，应用0.25%胰酶与1 mmol的EDTA消化液消化，按1∶3比例传代。

1.2 BMSCs的表型鉴定 应用0.25%胰酶与1 mmol的EDTA消化并收集细胞，将抗CD44、CD45、CD105抗体(Neomarker，USA)与细胞常温下孵育30～40 min。PBS洗涤2次后，加入FITC荧光标记的二抗，4℃避光孵育。20～30 min后PBS冲洗2次，加500μl PBS重悬细胞，应用流式细胞仪进行荧光检测与分析。对照组为未加一抗的细胞。

1.3 BMSC多向分化能力鉴定 取生长状态良好的P5代BMSC，以1×104/孔细胞数加入到24孔细胞培养板内培养，待细胞生长到80%～90%融合后，分别加入成脂诱导培养基与成骨诱导培养基，诱导14 d后，采用细胞进行油红O染色判定大鼠BMSC向成脂分化的能力，诱导21 d后，采用茜素红染色判定大鼠BMSC向成骨方向诱导的能力。

1.4 BMSCs向心肌细胞的诱导分化及鉴定 选择生长状态良好的P5代BMSCs，以1×105/孔细胞数接种于置有盖玻片的24孔板中，当细胞融合达到60% ～70%时，加入5-氮杂胞苷(5-Aza，USA)，其终浓度为10μmol/L，37℃孵育24 h后换成不含诱导剂的培养基继续培养。对照组不加5-Aza诱导剂。将含有诱导后的BMSCs细胞的载玻片水化10 min，加入阻断剂孵育30 min后PBS冲洗3次，滴加血清封闭30 min，接着滴加抗TroponineI(Neomarker，USA)一抗 20 μl，4℃ 过夜，PBS 冲洗 3次，滴加生物素标记的二抗，37℃作用30 min，PBS冲洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃作用30 min，PBS冲洗3次，加入DAB显色，苏木精复染核，酒精系列脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.5 RT-PCR检测RhoA基因表达 消化并收集5-Aza诱导前后的细胞，应用RNA提取纯化试剂盒按照说明书步骤提取细胞总RNA。应用一步法逆转录试剂盒说明进行逆转录以及PCR反应，分别取两组提取的RNA 500 ng，每组内分别加入RhoA基因上下游引物1μl，内参照 β-actin上下游引物各0.5μl以及PCR反应液，总体积为20μl。按照以下条件进行RT-PCR反应:50℃ 50 min RT反应，94℃ 2 min灭活 RTase，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s延伸，循环 40 次。PCR 产物应用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，拍照。引物序列:β-actin上游:5'-TGTATGCCTCTGGTCGTACC-3'，下游:5'-CAACGTCACACTTCATGATGG-3'，PCR产物片段417 bp;RhoA上游:5'-GTGATTGTTGGTGATGGAGC-3'，下游:5'-CTCGTGGCCATCTCAAAAAC-3'，PCR 产物片段 503 bp。

2 结果

2.1 BMSCs的形态学观察 接种于培养瓶内的细胞在3～4 d后逐渐出现贴壁细胞，残留的各种类型的血细胞通过完全换液在6 d后逐渐被除去。贴壁细胞呈长梭形，为单个或几个细胞的克隆，细胞形态均一 。培养至10～18 d后，细胞生长达到80%～90%的融合，细胞克隆表达并相互重叠，但无接触抑制现象。传代后的BMSCs形态均一，生长旺盛，成纤维细胞样紧密排列，细胞间界限不清。见图1。

2.2 BMSC多向分化能力鉴定结果 BMSCs成脂诱导14 d后油红O染色显示细胞内有染成红色的脂滴，并伴有脂肪空泡(图1B)。BMSCs成骨诱导21 d后茜素红染色显示细胞有钙化结节形成，为红色的致密结节(图1C)。

2.3 BMSCs免疫表型鉴定 流式细胞术检测结果显示，培养的BMSCs细胞表面表达CD44与CD105，细胞表达率为95%以上，而细胞基本不表达CD45，说明培养的细胞为间质来源。

2.4 BMSCs向心肌细胞诱导分化的形态学观察及鉴定结果BMSCs经10μmol/L 5-Aza定向诱导24 h后，细胞形态变得不规则，部分细胞逐渐变长，2 w后细胞逐渐由长梭形变为多角形及星形，类似心肌细胞，TroponineI蛋白免疫组化检测结果显示向心肌方向诱导的BMSCs表达心肌细胞特异性TroponineI蛋白。见图2。

2.5 RhoA基因RT-PCR检测结果 BMSCs没有检测到RhoA基因表达，而诱导后的BMSCs检测到RhoA基因表达。见图3。

图1 培养第5代的BMSCs及分化潜能

图2 免疫细胞化学染色示TroponineI表达

图3 RT-PCR检测RhoA基因

3 讨论

BMSCs作为细胞移植治疗的重要来源细胞，具有取材方便，无伦理及移植免疫排斥等问题、该细胞体外容易培养以及大量扩增，同时容易定向诱导分化。目前，通过BMSCs诱导分化获得心肌样细胞的技术还不成熟。有研究结果显示BMSCs应用5-Aza诱导分化后，能够形成心肌肌管样结构，并表达MC特异性表面抗原标记。因此说明BMSCs具有向心肌样细胞分化的潜能，为BMSCs用于MC损伤后的修复提供了理论上的依据〔6〕。5-Aza现已成为诱导BMSCs向MC分化的常用诱导剂，但其原理尚未完全阐明，其机制可能是5-Aza控制干细胞向MC分化的相关DNA的去甲基化，启动相关促进干细胞向MC分化的转录因子的表达。

本研究显示培养获得的BMSCs形态以及表面标志物符合间充质干细胞特点。说明本实验获取的细胞是纯度较高的大鼠BMSCs，而且BMSCs已经成功向MC分化。

有研究显示Rho/ROCK信号途径在5-Aza促进BMSCs向MC分化的过程中发挥重要作用。RhoA是细胞内传导抑制信号、参与信号级联放大过程中及调控细胞支架动力学的关键物质。ROCK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞内参与细胞骨架动力学与DNA表达调控〔7〕。Rho调节ROCK活性，细胞处于静息状态时ROCK不具备酶活性，当Rho传递活化信号后，ROCK发生磷酸化并被激活，使肌球蛋白磷酸酶发生磷酸化并失去活性，导致细胞内肌球蛋白轻链脱磷酸化，引起肌动蛋白微丝骨架的聚合〔8〕。5-Aza能够通过来诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化。在实验中我们发现，在BMSCs向心肌细胞分化过程中表达RhoA。因此，5-Aza促进BMSCs向MC分化可能是通过Rho/ROCK信号途径来调控的。

1 Krause DS.Bone marrow-derived cells and stem cell s in lung repair〔J〕.Proc Am Thorac Soc，2008;5:323-7.

2 Morito T，Muneta1 T，Hara K，et al.Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans〔J〕.Rheumatology，2008;47:1137-43.

3 Keiichi F，Shinsuke Y.Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes〔J〕.Circ Res，2006;4:1002-13.

4 Tan SCW，Pan WX，Ma G，et al.Viscoelastic behaviour of human mesenchymal stem cells〔J〕.BMC Cell Biol，2008;9:40-7.

5 Summer R，Fine A.Mesenchymal progenitor cell research:limitations and recommendations〔J〕.Proc Am Thorac Soc，2008;5:707-10.

6 Hidemasa OH，Bradfute SB，Gallardo TD，et al.Cardiac progenitor cells from adult myocardium:homing，differentiation and fusion after infarction〔J〕.PNAS，2003;100(21):123-7.

7 Tanaka T，Nishimura D，Wu RC，et al.Nuclear Rho kinase，ROCK2targets p300 acetyl transferase〔J〕.J Biol Chem，2006;281(22):15320-9.

8 Sbimokawa H，Takeshita A.Rhokinase is an important therapeutic target in cardiovascular medicine〔J〕.Arterioscler thromb Vatw Biol，2005;25(9):1767-75.