生防地衣芽孢杆菌BLA1对植物病害的抑制作用研究

彭 玲,胡 颖,罗冰科

(武汉生物工程学院,湖北武汉430415)

生防地衣芽孢杆菌BLA1对植物病害的抑制作用研究

彭 玲,胡 颖,罗冰科

(武汉生物工程学院,湖北武汉430415)

对地衣芽孢杆菌01101107进行诱变筛选获得了高抑菌性突变株地衣芽孢杆菌BLA1,检测了菌株BLA1对几种植物病原微生物的抑制性能、对植物外植体感染的保护性以及对田间作物生长的促进作用。结果表明,地衣芽孢杆菌BLA1对植物病害具有良好的防治作用,是理想的生防菌筛选对象。

生防菌;地衣芽孢杆菌;病原菌;拮抗性

植物病害是造成农业损失的主要原因之一。近几十年来,化学农药在防治农作物病虫害方面起着重要的作用,但是化学农药的长期不合理使用也产生了一系列的问题,如农药残留对人、畜健康的危害、病虫害抗药性的不断提高、对环境的污染等等。因此,探寻对人类和环境友好并具有良好防治效果的新型生物农药是现代农业生物技术发展的新趋势[1]。自1921年Hartely利用真菌防治猝倒病(Pythium debaryanum damping-off)[2]以来,植物生防菌的研究和应用一直备受关注。

目前,已有多种生防菌得以应用,如芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)、土壤放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)等[3],尤其是芽孢杆菌,因其具有耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子[4,5],并且具广谱的抗菌范围,是理想的生防菌筛选对象[6]。已报道的生防芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)等[7]。近几年来,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)因其稳定性强,可产生多种抗性物质,尤其是对植物病害具有较强的防治效果,越来越多地受到关注。

作者通过诱变筛选得到抗菌能力较强的地衣芽孢杆菌BLA1,并对其进行了植物病原菌的拮抗性实验,以期进一步开发出商品化的植物生防菌剂应用于农业生产。

1 实验

1.1 实验作物、菌种与培养基

桑树叶,采自校园;辣椒秧苗,市售。

出发菌株:地衣芽孢杆菌01101107,武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室提供。

指示菌株:金黄色葡萄球菌(Staphyloccus aureus),武汉生物工程学院微生物学实验室保藏。

植物病原菌:分离自中国农科院油料研究所阳逻基地污染土壤。

牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2 方法

1.2.1 地衣芽孢杆菌01101107的诱变筛选

对出发菌株地衣芽孢杆菌01101107采用紫外线照射和吖啶橙处理诱变,以金黄色葡萄球菌为指示菌,经琼脂块大通量法筛选[8],获得高抑菌性的突变株地衣芽孢杆菌BLA1。

1.2.2 地衣芽孢杆菌BLA1对金黄色葡萄球菌抑制性能的检测

将BLA1菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基, 37℃下摇瓶发酵培养24 h,得发酵液;发酵液经0.22 μm的微孔滤膜过滤器过滤,得去菌液。以金黄色葡萄球菌为指示菌,采用滤纸片抑菌圈法和牛津杯抑菌圈法,分别对BLA1发酵液和去菌液进行抑菌性检测。

1.2.3 植物病原菌的分离及初步鉴定

采集中国农科院油料研究所阳逻基地的致病菌污染油菜地土壤样本,对土壤溶液进行梯度稀释,涂平板,分离单个菌落,经形态鉴定以及对离体叶片的感染实验,初步鉴定为对植物体具有腐败性的致病性细菌,编号为HL1～HL8。

1.2.4 地衣芽孢杆菌BLA1对植物病原菌的抑制性能检测

摇瓶发酵培养BLA1菌株24 h,得发酵液;发酵液经0.22μm的微孔滤膜过滤器过滤,得去菌液。采用滤纸片抑菌圈法,以HL1～HL8为敏感菌,分别取BLA1发酵液和去菌液进行抑菌实验,检测BLA1对植物病原菌HL1～HL8的拮抗性。

1.2.5 植物外植体感染实验

将新鲜嫩桑叶剪成约5 cm×5 cm的正方形,经升汞和75%酒精消毒后,放入BLA1去菌液中浸泡30 s,然后分别将未经去菌液浸泡和浸泡过的桑叶平铺在涂有植物病原菌(HL)菌液的平板上,37℃下恒温培养36 h。

1.2.6 作物田间实验

将发酵培养18 h的BLA1菌液按照一定比例和市售有机肥拌匀,每蔸打此底肥50 g,栽种株高约10 cm左右的辣椒秧苗,以不施有机肥、施不加发酵菌液的有机肥为对照组,每组30株。每2～3 d浇水1次,不做其它处理,10 d后观察辣椒秧生长情况。

2 结果与讨论

2.1 地衣芽孢杆菌BLA1对金黄色葡萄球菌的抑制性能

实验发现,地衣芽孢杆菌BLA1发酵液的滤纸片抑菌圈直径达20 mm(含滤纸片,以下同)以上,去菌液的牛津杯抑菌圈直径也达15 mm左右。表明地衣芽孢杆菌BLA1对指示菌金黄色葡萄球菌具有显著的抑制效果。

2.2 地衣芽孢杆菌BLA1对植物病原菌的抑制性能

采用滤纸片抑菌圈法检测地衣芽孢杆菌BLA1对植物病原菌的抑制性能,结果见表1。

表1 菌株BLA1对植物病原菌的抑制性能(抑菌圈直径:mm)Tab.1 The antibacterial activity of strain BLA1 to the plant pathogenic bacteria HL1～HL8(inhibition zone diameter:mm)

由表1可知,菌株BLA1对植物病原菌HL1～HL8的抑菌圈直径最大可达12 mm,虽然不如对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大,但也具有较明显的拮抗性。

2.3 植物外植体感染实验结果

植物外植体感染实验发现,HL致病菌对外植体桑叶具有强烈的腐败作用,经36 h恒温培养后,桑叶只剩下依稀可辨的叶脉,叶肉全部腐烂,被细菌降解(图1)。而在BLA1去菌液中浸泡过的桑叶则完好无损,并且平板培养基上几乎未长出HL菌落(图2)。可见,BLA1去菌液中具有抑制病原菌HL生长的因子,并对叶片具有保护作用。

2.4 地衣芽孢杆菌BLA1对田间作物生长的促进作用

田间实验结果表明,施加混有BLA1菌液的有机肥的辣椒秧苗长势较好,茎杆较粗壮,叶片呈深绿色,花蕾较多,果实较大;且植株周围较少生长杂草,尤其不易生长禾本科类杂草。而没有添加BLA1的对照株则长势一般,茎杆较细,叶片小而发黄,花蕾和幼果易受害虫侵扰而凋落(未施农药杀虫),植株周围杂草丛生(未进行人工除草)。可见,地衣芽孢杆菌BLA1对植物生长有明显的改善作用。

图1 HL对叶片的腐烂作用Fig.1 The role of HL to blade rot

2.5 讨论

本实验采用理化因子诱变获得高抑菌性地衣芽孢杆菌BLA1,通过滤纸片法和牛津杯法均证实其对金黄色葡萄球菌和几种植物病原菌具有显著的抑制效果,并且通过进一步的外植体感染实验和田间实验证实了菌株BLA1对植物病原菌的拮抗性和对植物生长的促进作用,为进一步开发生防菌提供了较好的条件。

图2 BLA1去菌液对叶片的保护及对HL的抑制作用Fig.2 The protection to blade and the inhibition to HL of BLA1 filtrate

但是,后续研究需要对下述问题进行深入探讨: (1)菌株BLA1对几种植物病原菌的拮抗性强弱不同,因不同的芽孢杆菌抗菌谱不同,所以需要进一步对病原菌进行鉴定,以期开发出更具针对性和更强效的生防菌,应用于农业生产;(2)菌株BLA1的抗菌活性成分的分离鉴定及抗菌机理的研究;(3)近年来,国际上将土壤中能促进植物生长的根际自生细菌统称为植物促生根圈细菌(Plant growth promoting rhizobaceria,简称PGPR)。B.subtilis类PGPR是研究比较深入系统并在生产实践中推广应用较多的主要PGPR类细菌之一[9]。考虑到生防菌对植物生长促进作用的复杂性,虽然本实验中菌株BLA1对作物生长具有一定的改善作用,但田间实验偶发因素多,不排除其它因素对植物生长的影响,因此,需要开展更多相关的实验,以期获得更全面更科学的数据。

3 结论

对地衣芽孢杆菌01101107进行诱变筛选获得了高抑菌性突变株地衣芽孢杆菌BLA1,检测了菌株BLA1对几种植物病原微生物的抑制性能、对植物外植体感染的保护性以及对田间作物生长的促进作用。结果表明,地衣芽孢杆菌BLA1对植物病害具有良好的防治作用,是理想的生防菌筛选对象。

[1] 李晶,杨谦.生防枯草芽孢杆菌的研究进展[J].安徽农业科学, 2008,36(1):106-111,132.

[2] Adhikari T B,Joseph C M,Yang G,et al.Evaluation of bacteria isolated from rice for plant growth promotion and biological control of seeding disease of rice[J].Microbio,2001,47(10):916-924.

[3] 程亮,游春平,肖爱萍.拮抗细菌的研究进展[J].江西农业大学学报,2003,25(5):732-737.

[4] Obagwu J,Korsten L.Integrated control of citrus green and blue molds using Bacillus subtilis in combination with sodium bicarbonate or hotwater[J].Postharvest Biology and Technology, 2003,28(1):187-194.

[5] Emmert E A,Handelsman J.Biocontrol of plant disease:A(Gram-) positive perspective[J].FEMS Microbiol Letters,1999,171:1-9.

[6] 杨佐忠.枯草杆菌拮抗体在植物病害生物防治中的应用[J].四川林业科技,2001,(9):41-43.

[7] Shoda M.Bacterial control of plant diseases[J].J Biosci Bioeng, 2000,89(6):515-521.

[8] 彭玲,熊何,孟小林.诱变处理增强地衣芽孢杆菌01101107抑菌性的研究[J].化学与生物工程,2008,25(8):55-57.

[9] 黄海婵,裘娟萍.枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展[J].浙江农业科学,2005,(3):213-215.

Study on Inhibition Effects of Biocontrol Bacillus Licheniformis BLA1 on Plant Disease

PENG Ling,HU Ying,LUO Bing-ke
(Wuhan Bioengineering Institute,Wuhan 430415,China)

Bacillus licheniformis BLA1 with high antibacterial activity was obtained from Bacillus licheniformis 01101107 by mutagenesis.The inhibition effects of strain BLA1 on several plant pathogenic microorganisms were investigated,and its protection effect on the plant explant infected and promotion effect on crop growth in the field as well.The results showed that Bacillus licheniformis BLA1 had good prevention and curative function to plant diseases,which was an ideal object for screening biocontrol bacteria.

biocontrol bacteria;Bacillus licheniformis;pathogenic bacteria;antagonism

Q 939

A

1672-5425(2013)05-0046-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.05.012

武汉市市属高等学校科学研究项目(2009K090)

2013-03-01

彭玲(1974-),女,湖北咸宁人,硕士,讲师,研究方向:工业微生物育种,E-mail:648232802@qq.com。