细胞分裂素对金钗石斛开花及其VRN1-like基因表达的影响

闻真珍，刘运权，林首恒，林 茵，刘 伟

(华南农业大学生命科学学院，广东广州510642)

金钗石斛(Dendrobium nobile)具有很高的观赏价值，是春石斛育种中最常用的亲本之一［1］．春石斛花芽的形成需要一定时间的低温即春化作用的诱导，不完善的催花技术导致目前年花市场国产金钗石斛等春石斛质量低下，竞争力远低于进口产品．生产中普遍采用冷库或高山基地进行低温处理调控花期，能耗和运输等成本高，其在春石斛的运用中效果也不稳定．研究表明，植物生长物质在植物花芽分化过程中发挥重要作用［2］，细胞分裂素(cytokinin，CTK)在促进石斛等兰花的花芽分化中效果明显［3］，利用 450 mg/L 6-BA 处理盆栽春石斛(red emperor“prince”orchid)，不经低温处理可诱导其开花［4］．但是利用CTK调控开花的技术还未在生产中推广，处理过程复杂、效果不稳定是主要原因．对花芽分化过程中CTK作用机理的研究，有助于该技术的完善和推广应用．

外源CTK诱导石斛成花的过程中，内源CTK含量增加［5］，油菜经低温诱导后，内源iP类CTK含量增加［6］，说明CTK通过影响内源CTK的含量影响花芽的分化，后者则参与了春化作用途径中的成花转换过程．DAVIS［7］提出在CTK合成部位根尖中，FLC和自主途径基因大量表达，其中CTK与这些基因之间可能具有一定的相互作用．FLC是拟南芥春化作用途径的关键基因，而在单子叶植物中，至今未克隆到相关同源基因，VRN1途径是目前单子叶植物中唯一已经确定的春化作用途径．VRN1是拟南芥中AP1/FUL的同源基因，其表达受春化作用上调［8］．最近，利用高通量测序技术分别从金钗石斛［9］和墨兰［10］转录组中分离到了 VRN1途径的同源基因，说明兰科植物春化作用途径与禾本科等单子叶植物类似．

本研究利用CTK类物质噻重氮苯基脲(thidiazuron，TDZ)在常温下处理金钗石斛成株，观察其对开花的影响．并通过同源克隆分离金钗石斛VRN1-like基因，利用半定量RT-PCR研究CTK处理对其表达的影响，以初步揭示CTK对金钗石斛开花的影响及其分子机理，为完善春石斛花期的化学调控技术提供基础．

1 材料与方法

1．1 材料

金钗石斛成株和类原球茎由华南农业大学植物化控实验室提供．金钗石斛成株栽培于华南农业大学植物种质繁育中心温室，选取生长状态一致、止叶完全展开的植株，于11月用20 mg/L TDZ喷洒叶片，清水处理为对照，置于日温20～26℃，夜温18～20℃下培养;另选取部分植株，置于日温20～26℃，夜温4℃下培养，所有材料每周淋水1次．处理后0、5、10、15、20、25、30 d 切取腋芽，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用;30 d后所有材料移至温室培养，日温20～26℃，夜温12～18℃(12月的自然温度，加风机水帘调控)，观察其开花情况;类原球茎在无激素培养基中继代培养30 d后，分别转入含有1．6 mg/L 6-BA和1．6 mg/L TDZ的培养基中培养;另取部分材料继续转接至无激素培养基，在4℃条件下继代培养，于转接 0、5、10、15、20 d 后取材，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用．

1．2 总RNA提取和cDNA第一链合成

用Trizol(Tiangen)法提取总RNA．以总RNA为模板，通过MMLV逆转录酶(TaKaRa)逆转录获得cDNA第一链．

1．3 金钗石斛DnVRN1基因保守区的合成

VRN1为AP1/FUL类MADS盒转录因子，根据GenBank中登录的兰科植物AP1/FUL类基因的序列和小麦等不同植物中的VRN1序列，设计特异性上游引物VF1(5'-TCTCCGTGCTCTGTGATGCT-3')和下游引物VR1(5'-GTGCCTGAGGTGATTCTTCTTC-3')，以1．2中得到cDNA为模板，通过PCR克隆DnVRN1保守区片段，得到的产物连接T载体后测序验证．

1．4 DnVRN1全长cDNA序列的扩增

根据获得的DnVRN1的保守区序列设计引物，利用3'-和5'-RACE，分离DnVRN1基因的cDNA全长并测序．用于3'-RACE的cDNA第一链的转录用接头引物AP1(5'-GACTCGAGTCGACATCGA(T)17-3')代替oligo(dT)18，PCR引物为基因特异性引物VF2(5'-GCCAAAGCATTGACGCA-3')和接头引物AP3(5'-GACTCGAGTCGACATCG-3')．采用TaKaRa 5'-Full RACE Kit进行DnVRN1 5'端未知序列的扩增，所用的基因特异性引物为VR2(5'-GGTTCTTCTTCATTGGCTCTTG-3')、VR3(5'-GGAGTTGGGACAGAATCGGAAATC-3')．为验证所得的序列，另用引物VTF(5'-CCACCCTCCACTCCATTCTT-3')/VR3(5'-GGAGTTGGGACAGAATCGGAAATC-3')扩增全长cDNA．

1．5 序列分析

利用DNAstar软件对DnVRN1全长cDNA进行拼接，通过 ORF Finder预测开放阅读框，并通过BlastX搜索同源蛋白．利用ClustalW对序列进行比对分析．

1．6 半定量RT-PCR分析DnVRN1的表达

根据DnVRN1全长序列设计引物QF(5'-AACCCCCAGGCTGATTG-3')和QR(5'-GGCTCTTGCTTGAAACG-3')，以Actin基因为内参(引物为AF(5'-TGCTTCTAAAGTTTGCTAT-3')和 AR(5'-ACTCAATCCAGACTACAA-3'))，进行半定量 RT-PCR．即在相同的扩增条件和相同的体系组成的条件下，分别对目的产物和参照基因进行PCR扩增，1%的琼脂糖凝胶电泳检测，通过比较产物的量初步研究目的基因的表达情况．为获得较准确的结果，设置了技术性重复和生物学重复，即每个PCR反应进行3次重复，每个处理也使用3个不同批次提取的总RNA样品．

2 结果与分析

2．1 TDZ对金钗石斛开花的影响

利用20 mg/L的TDZ喷施叶面30 d后，金钗石斛普遍形成花芽，诱导率100%，并于处理后90 d左右全部开花;低温处理30 d后，材料也普遍形成花芽，但开花时间较TDZ处理材料晚20 d左右;对照材料则无花芽形成(图1A)．以上结果表明，喷施TDZ能代替低温处理诱导金钗石斛开花．

2．2 金钗石斛VRN1-like基因全长cDNA序列的克隆

以金钗石斛类原球茎总RNA逆转录产物为模板，利用引物 VF1/VR1通过 PCR扩增得到了530 bp的保守区片段(图2)，Blast同源搜索表明该片段与球花石斛(Dendrobium thrysiflorum)中的FUL-like MADS-box基因(AY927236)具有高的同源性．根据这一片段设计基因特异引物，并通过RACE扩增基因的全长序列．3'-RACE扩增获得686 bp的末端片段(图2(2))，经测序，所得序列与MADS-BOX部分序列有重叠．两序列拼接获得包括了3'末端的cDNA片段．根据这一序列设计5'-RACE的基因特异引物，通过扩增获得1条648 bp的5'末端片段(图2(3))．经克隆测序表明，该片段可与3'-RACE产物拼接得到902 bp的全长cDNA序列．为验证上述结果，根据拼接后的序列重新设计引物，通过RT-PCR扩增得到了750 bp左右的完整ORF片段(图2(4))．BlastX搜索表明该序列编码的蛋白序列与小麦中VRN1蛋白同源，将其命名为 DnVRNA，GenBank，登录号为 EF535598．

图1 TDZ对金钗石斛开花(A)和腋芽中DnVRNA表达(B)的影响Figure 1 Effect of TDZ on flowering(A)and expression of DnVRNA in axillary buds(B)of Dendrobium nobile

图2 金钗石斛DnVRNA全长cDNA序列Figure 2 Isolation of full-length DnVRNA cDNA from Dendrobium nobile

2．3 DnVRNA 序列分析

本研究中获得的DnVRNA全长cDNA为902 bp(包括poly(A)序列)，包括部分5'UTR区、完整的ORF和3'UTR区(图3)．

图3 DnVRNA序列分析Figure 3 Sequence analysis of DnVRNA

得到的DnVRNA的ORF长741 bp，编码1条含247个氨基酸残基的多肽链，含1个MADS-BOX域和1个K-BOX域，为典型的MADS-BOX蛋白．5'UTR区长24 bp，可能并不完整，需要进一步试验确定．3'UTR区包括poly(A)尾在内长136 bp．蛋白比对分析表明，DnVRN1蛋白与禾本科植物小麦等的VRN1蛋白同源，其中与高羊茅(Festuca arundinacea)VRN1的氨基酸序列一致性为63%，与小麦(Triticum monococcum)VRN1蛋白的氨基酸序列一致性为62%，而与球花石斛中的 DthyrFL1具有95%的序列相似性．蛋白的C端具有6个氨基酸组成的单子叶植物FUL-like基因保守基序LPPWML/V(图4)．

图4 金钗石斛DnVRN1与其他物种VRN1蛋白序列比对分析Figure 4 Alignments of VRN1 protein from Dendrobium nobile and other organisms

2．4 CTK和低温处理对金钗石斛类原球茎中DnVRNA表达的影响

以DnActin基因为内参，通过半定量RT-PCR检测DnVRNA基因的表达变化，结果表明，TDZ处理可以促进金钗石斛腋芽中DnVRNA的表达(图1B)．为进一步分析CTK对DnVRNA表达的影响，以金钗石斛类原球茎为材料，分别用1．6 mg/L的6-BA和TDZ处理后，检测其中DnVRNA的表达情况．半定量RT-PCR结果显示6-BA和TDZ都能显著促进DnVRNA表达．另外，低温处理(4℃)也能促进类原球茎中DnVRNA的表达(图5)．类原球茎是含有胚性细胞团的分生能力活跃的分生组织，其中基因的表达情况能在一定程度上反映出其在腋芽中的表达情况，本研究中TDZ处理后，在腋芽和类原球茎中DnVRNA表达量都增加．

图5 CTK和低温处理后金钗石斛类原球茎中DnVRNA表达Figure 5 Expression analysis of DnVRNA in PLBs of Dendrobium nobile after treated by CTK and cold

3 讨论

用CTK类化学物质调控春石斛开花，能有效地降低生产成本．春石斛催花中使用最多的是6-BA，但都是在相对低温(18～20℃)的条件下使花期提前［3］．SAKAI等［4］的研究表明，6-BA 可以在不经低温处理的情况下诱导春石斛开花．在春石斛离体培养过程中，TDZ是除6-BA之外使用最多的开花诱导物，能显著促进铁皮石斛等在内的春石斛开花［11］．本研究利用TDZ在常温下成功诱导了金钗石斛成株开花，花芽诱导率达到了100%，与低温诱导相比，花期提前了20 d左右，且花朵形态色泽无变化，与6-BA对春石斛的作用一致，TDZ可以替代低温诱导金钗石斛成花．对其分子机理的深入研究，将有利于该技术的完善和实际应用．

目前对金钗石斛成花的分子机理缺乏了解，相关研究的进行有待更多花发育相关基因的克隆及其功能研究等基础工作的积累．LIANG等［9］通过cDNA文库测序，分离了1个VRN1-like基因DnVRN1，该基因编码的蛋白与小麦VRN1蛋白(AAZ76882．1)的序列相似性为61%，其表达受春化作用的上调．说明春化作用诱导金钗石斛成花的分子机理可能与单子叶植物中已经确定的VRN1途径类似．本研究通过同源克隆获得了另一个VRN1-like基因DnVRNA，其编码的蛋白序列与小麦VRN1蛋白和DnVRN1的序列相似性分别为62%和61%，说明DnVRNA和DnVRN1为金钗石斛中的VRN1-like同源基因．另外，同源比对分析表明，DnVRNA是球花石斛中DthyrFL1的同源基因，在花发育过程中，DthyrFL1的表达量随花芽的分化而增加［12］，这与DnVRNA在类原球茎中的表达受低温诱导的结果一致，说明该基因可能参与春化作用途径．

本研究发现的DnVRNA参与春化作用途径，而CTK可以诱导DnVRNA在腋芽和类原球茎中的表达，表明该基因在CTK替代低温诱导金钗石斛成花的过程中具有一定的作用．对于细胞分裂素和花发育相关的MADS-box基因之间的关系，早期就有相关报道．ESTRUCH等发现细胞分裂素可以改变花器官的发育，并抑制3种 MADS-box基因:DEFA，GLO，PLENA 的表达［13］．在风信子(Hyacinthus orientalis L．)的再生花芽中，细胞分裂素可以调节AG类MADS-box基因HAG1的活性，进一步诱导花芽的发生并决定花器官的类型［14］．而使用低浓度的细胞分裂素处理白芥菜(Sinapis alba)植株的顶端，可以代替长日条件激活SOC1同源基因SaMADS A的表达，进而引起花转换的发生［15］．在短日条件下，CTK通过调控FT同源基因TSF及其下游基因SOC1 表达促进拟南芥开花［16］．DAVIS［7］提出 CTK与自主途径基因以及春化作用途径关键基因FLC之间可能具有一定的相互作用．上述研究中，SOC1是春化作用、自主途径、GA途径诱导开花过程中的整合基因，其表达量的增加可以直接促进下游目标基因的表达，诱导植物开花［17］．而FLC是拟南芥春化作用途径中的关键基因［8］，本研究发现DnVRN1可能参与春化作用的调控，CTK对其表达的影响，或许可以部分解释CTK代替春化作用诱导金钗石斛开花的原因，但是其具体分子机理的阐释还需要进一步的研究．

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