马腺疫快速诊断方法的建立与应用

包拉提.吾木尔别克

(昭苏县畜牧兽医站 新疆伊犁 835600)

马腺疫是由马腺疫链球菌引起的马的一种接触性的急性传染病,驴驹易发此病,病菌随脓肿破溃和病马喷鼻、咳嗽排出体外,污染空气、草料、水等,经上呼吸道黏膜、扁桃体或消化道感染健康马匹[1]。马腺疫的潜伏期平均4-8天,由于马匹体抵抗力的强弱和细菌的毒力以及数量的不同,其在临床表现上也不同[2]。病马特别是开放性鼻疽马是主要传染来源,该病主要经消化道或经损伤的皮肤粘膜而感染,因此常有同槽马匹暴发本病的实例。在诊断中,传统的诊断方法的步骤繁琐,诊断效果也不太好[3]。本文具体建立了基于PCR的马腺疫快速诊断方法,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大肠杆菌(E.coli)DH5α、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、pET22b(+)质粒本实验室保存,马链球菌Se39612基因本实验室提取。PCR扩增仪(BioRad公司)、台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)、UV9100紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)、凝胶成像分析仪(BioRad公司)和台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)。

1.2 马链球菌Se39612基因的获得

从屠宰场取病马尸体,采取TRIzol法提取组织的总RNA。然后采用RT-PCR法获得马链球菌Se39612基因。RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术,首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。根据NCBI上已公布的马链球菌Se39612基因序列,通过PrimerPremier10.0引物设计软件设计两条引物P1/P2,分别为马链球菌Se39612基因上游引物P3(含有NdeⅠ酶切位点)和下游引物P4(含有HindⅢⅢ酶切位点)。用宝生物公司(大连)有限公司的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0把RNA合成cDNA,然后再对此cDNA进行扩增获得马链球菌基因。

1.3 马链球菌Se39612表达载体的构建

首先进行原核表达载体pET22b(+)的质粒提取,然后进行重组质粒的构建,氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌DH5α感受态细胞,最后进行ET22b/pSe39612重组菌的诱导表达。

1.4 pET22b/pSE39612的蛋白表达

将pET22b/pSE39612菌液按1%接种量转接至新鲜LB液体培养基后,继续培养至OD600≈0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG,诱导6h后收集菌体,12%SDSPAGE蛋白电泳检测。将凝胶置于平皿中,加入考马斯亮蓝染色液G250,置于脱色摇床上轻轻摇动2-3h,再将凝胶置于盛有脱色液的平皿中,于脱色摇床上脱色2-3h或过夜,其间更换多次脱色液直至背景清楚。用凝胶成像仪拍照保存。将构建好的马链球菌基因工程菌pET22b(+)/pSE39612接种于30mLLB液体培养基中,37℃振荡培养12h,按1.0%接种量转接至新鲜培养其中培养至OD600≈0.6时,加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h后收集菌体。将菌体悬浮于硼酸硼砂盐缓冲液中(pH8.4),冰浴中超声破碎,离心后的上清液即为粗液,进行western杂交分析。

2 结果

以病马组织提取的总RNA为模板,用TaKaRa宝生物公司(大连)有限公司AMV逆转录试剂盒,通过RT-PCR法获得马链球菌基因。在1000bp处有一条带,与预期大小1062bp相符。通过对重组尿酸酶基因工程菌的菌体进行SDS-PAGE检测,在39.61kDa处有明显的蛋白表达条带,与马链球菌Se39612蛋白的亚基相对分子质量相同。Western分析检测该蛋白与阳性血清反应。

3 讨论

马腺疫是由马腺疫链球菌引起的马属动物的一种急性、热性传染病。4个月龄至5岁以内的马驹易感染马腺疫,特别是1周岁左右的幼驹易感性最强。患病和病死动物是主要传染源,无症状和病愈后的带菌动物也可排出病菌成为传染源[4]。在临床表现上,初病马精神沉郁,食欲减少,体温升高到39℃-41℃。颌下淋巴脓肿破溃,流出大量脓汁,这时体温下降,炎性肿胀亦渐消退,病马逐渐痊愈。而如果病马抵抗力很弱,加之治疗不当,则本病原菌可沿淋巴管或血液转移到其他淋巴结或器官,形成转移性病灶,结果进一步引起严重的全身症状。带菌的马匹在气候突变、过劳、厩舍通风不良、营养不良等因素影响下,使其抵抗力下降时,可发生内源性传染。

从病原上分析,马腺疫链球菌在脓汁中呈长链状排列,本菌无运动性,不形成芽胞,但能形成荚膜。对外界环境的抵抗力较强。在干燥脓汁及鼻液中能存活数周。在诊断中,常规需要综合判断,幼驹体温升高(39℃-41℃)、颌下淋巴结肿大,随着炎症的发展,肿胀的淋巴结化脓破溃。采取脓汁,分离出链球菌,该菌不发酵蕈糖、山梨醇、甘露醇和乳糖,即可诊断为马腺疫。在鉴别诊断中,必要时采取病马的脓汁、鼻汁和实质器官的化脓灶的脓汁涂片,碱性美蓝染色,镜检出腺疫链球菌即可确诊。而恶性型腺疫患畜,体温呈稽留热、贫血、黄疸,用抗生素及解热药治疗效果不佳,易与马传染性贫血病混淆,但有典型的腺疫病史,白细胞总数及中性粒细胞数明显增多。马传染性贫血病病马的粘膜可能有出血点,心脏机能紊乱,白细胞数接近正常或略减少,马传染性贫血抗体检测阳性。颌下淋巴结硬固肿胀,无热痛,不化脓,往往不能移动,且鼻疽有特征性的鼻疽结节和溃疡,或放射状疤痕,鼻疽菌素点眼试验呈阳性反应。

随着生物学技术的发展,基于分子生物的快速诊断方法在动物疫情中的诊断得到了广泛应用。本文采用Trizol法从兵马组织中提取细胞总RNA,通过RT-PCR法扩增出马链球菌基因,将马链球菌基因转化到E.coli.BL21(DE3)表达菌株的感受态细胞中,涂布于含有Amp的LB平板上,倒置12-16h后挑取单菌落,提取质粒和PCR验证,电泳检测正确。将阳性转化菌经过转接后诱导至对数生长期,加入诱导剂IPTG进行诱导,收集菌液进行SDS-PAGE蛋白电泳检测,发现明显蛋白质条带,Western分析马链球菌Se39612是有表达且有活性的。

而在马腺疫链球菌的预防与管理中,对断乳前后的幼驹及岁左右的马匹,尽量做到全价饲养,增加户外运动,秋、春季节防止幼驹受凉感冒等。在流行马腺疫时,对未发病的幼驹,可用磺胺类药物预防。病初淋巴结轻度肿胀未化脓时,为消除炎症,促进吸收,可应用樟脑酒精、复方醋酸铅等局部涂擦轻度刺激剂。如炎性肿胀严重,而且硬固而无波动,则于局部涂擦如一松节油软膏等强烈刺激剂,促进脓肿成熟。当脓肿中心脱毛,有少量浆液渗出,触之柔软而有波动,应及时切开,充分排出;严防病马混入健康马群,新引进的幼驹应隔离观察2周。在春、秋气候骤变易发病季节,应勤检疫,发现病畜立即隔离治疗。病畜厩舍和污染的用具等,应用3%的来苏儿等消毒。总之,基于PCR的马腺疫诊断方法能快速进行疫情的诊断与病情判断,为疫情的预防与管理提供参考,具有重大的现实意义。

[1]柯春林,乔德亮,曾晓雄.兽疫链球菌荚膜多糖对免疫抑制鼠的抗氧化和免疫调节活性研究[J].中国微生态学杂志,2011年23卷08期 18-22页.

[2]唐芹芳,居会祥,金浩,等.从血液中分离出停乳链球菌似马亚种1例[J].江苏大学学报(医学版),2008年18卷第06期.

[3]韩秀兰,李云,董永辉.从一起暴发疫情分离的停乳链球菌似马亚种检测分析[J].预防医学论坛,2004年10卷第06期.

[4]侯伟伟,肖倩茹,张丽,等.从血流中分离停乳链球菌似马亚种1株[J].国际检验医学杂志,2012年33卷第16期.