酶反应提取技术在中药化学成分提取中的应用

2013-08-15王忠雷杨丽燕曾祥伟李朋收张小华

世界中医药 2013年1期

王忠雷杨丽燕曾祥伟李朋收张小华

(1北京中医药大学中药学院，北京，100102;2中国石油大学(北京)理学院;3北京丰泰金源药业有限公司)

随着中药研究与开发现代化的进程，经典的提取方法如溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、压榨法及升华法等因有效成分提取率不高、杂质清除率低等弊端，已经难以满足社会发展的需求。而一些新型、高效的提取新技术、新方法，已在近年的中药研究中陆续显现出各自的优势。笔者仅以酶反应提取技术为例，论述其在中药化学成分提取中的应用进展及方法特点，以期中药提取新技术能够更加合理有效地应用于中药研发过程［1］。

1 酶的古代应用及酶提取技术的形成

一方面，人类在生产活动中有目的地利用生物酶已有几千年历史，例如酿酒、制作饴糖、制酱等。从龙山文化遗存的大量陶制贮酒可以推知，远在5000年前，我们祖先已开始人工酿酒了;早在3000多年前国人已应用微生物发酵方法进行麻纤维的沤渍脱胶;另外，在1000多年前的《齐民要术》中已有用“鱼酱汁”来调味的论述。但由于历史原因和科技的限制，当时的人们没有意识到、也不可能意识到这是“酶”在起作用［2］。

另一方面，酶反应提取技术真正形成则源于近代。酶化学是从1814年，Kirchhoff发现淀粉酶以后开始的。1926年，Sumner首次得到尿酶结晶以及Northorp对蛋白水解酶的研究，逐步建立酶化学的基础。20世纪50年代中期，多学科的互相渗透使酶化学迅速发展。人们通过对氨基酸排列结构，酶的生物催化活性本质以及酶的专一性等的研究，使生物酶的应用逐步发展成为制药工业的重要手段之一。然而酶法在中药提取中的应用到20世纪90年代才陆续见报。21世纪以来，酶反应提取技术在中药化学成分提取中的应用日益普遍，并取得了较好的效果［3］。

2 酶反应提取技术的原理及特点

植物类药材约占中药总量的90%，其活性成分主要存在于植物细胞壁内。因此，细胞壁的多糖类物质所构成的致密结构自然成为了中药有效成分提取的主要屏障。而酶反应提取技术，即向待提取的中药液中加入某些特定的酶，通过破坏构成细胞壁的纤维素的基本单元的β－葡萄糖苷键等，导致细胞壁等处的纤维素、果胶等物质降解，从而使其致密性降低，以减少细胞原生质中的有效成分向溶媒扩散时细胞壁及细胞间质的阻力，进而有利于有效成分的提取。以上内容即为酶反应提取技术的基本原理。

酶反应提取技术在中药有效成分提取中得到越来越广泛的应用源于其如下特点:在较温和的条件下提取，提取产物活性较高，稳定性较好。但是，酶反应提取技术同时受到最佳反应温度、pH值、酶及底物浓度、抑制剂和激动剂对提取物的影响等条件的制约［4］。

3 酶提取技术在中药中的应用

中药品种繁多，有效成分的类型差异较大，因此需要按实际情况选择不同种类的酶来提取。常用的酶反应提取方法有复合酶法、纤维素酶法、果胶酶、超声酶法及转苷酶法等。

3.1 纤维素酶法植物细胞壁主要成分是纤维素，干燥植物体中纤维素占1/3～1/2，是形成植物细胞壁的框架。纤维素是β－葡萄糖以β－1，4－糖苷键连成的直链分子，而纤维素酶可降解β－1，4－糖苷键从而破坏植物细胞壁［5］。韩伟等［6］采用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等酶法提取积雪草中的积雪草苷，结合正交试验，结果发现，在纤维素酶与底物积雪草质量比m(E)∶m(S)=1∶50的时候，具有较理想的提取率。与传统提取方法相比，酶法提取速率快，工艺条件温和，得率高，是一种良好的提取方法。马桔云等［7］在从中药饮片中提取穿心莲内酯之前，先对原药材饮片进行纤维素酶解处理以破坏β－葡萄糖苷键，其他条件与原工艺相同，结果发现穿心莲内酯的含量和提取量均较原提取工艺高，且对所提取有效成分没有影响，并考虑将它用于穿心莲提取的工业化生产中。李永生等［8］通过比较纤维素酶、半仿生、乙醇回流提取方法对川乌中乌头碱、乌头总碱的影响，筛选最佳方法，利用纤维素酶辅助提取川乌生物碱，以乌头碱、乌头总碱提取率为指标，正交试验优化纤维素酶的最佳提取条件，再与半仿生、乙醇提取方法进行比较。实验证明，酶用量8mg/g时乌头碱提取率高达0.002 447%，乌头总碱提取率高达0.244 410%，而半仿生提取乌头碱、乌头总碱的提取率分别为0.001 735%、0.189 340%，乙醇回流提取乌头碱、乌头总碱提取率分别为0.001 869%、0.200 720%，可知纤维素酶提取法具有明显的优势。张华芳［9］等研究表明，用纤维素酶法提取羊栖菜多糖，以褐藻胶得率和羊栖菜粗多糖为定量指标，采用正交设计优选酶法提取条件，所得的多糖的质量分数为4.89%，较水提醇沉法、碱提醇沉法等有显著提高。

3.2 果胶酶果胶酶由黑曲霉发酵所得，是分解果胶复合物的酶的总称，可分为果胶甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶。蓝峻峰等［10］通过添加果胶酶提取叶下珠有效成分，以没食子酸提取率为考察指标，用高效液相色谱法测其含量，利用正交试验设计优选其提取工艺，结果发现，在果胶酶浓度为1.5g/L时，叶下珠没食子酸的平均提取率高达1.053%。因该工艺条件在较低的温度下、较短的时间内可较大程度提高叶下珠有效成分提取效率，故而有效地降低了提取能耗，而且提取过程中不使用有机溶剂，对环境友好，易于实现绿色工业化生产。李玲等［11］研究采用果胶酶提取川芎多糖的最佳工艺条件，方法为采用单因素实验和正交设计进行优选，考察酶用量、pH、反应时间和反应温度对川芎多糖提取的影响。结果发现，在果胶酶用量为1%条件下，川芎多糖的平均得率高达11.3%。

3.3 复合酶法复合酶法因其操作简单、高效、稳定等优点近几年已被广泛应用在中药活性成分的提取中。刘颖新等［12］以毛脉酸模的根为原料，采用复合酶提取，通过正交试验优选条件，实验表明，在所用酶量为3%时对其有效成分有较理想的提取。王颖莉等［13］研究酶法结合传统回流法提取远志总皂普工艺条件，利用可见分光光度法测定远志总皂苷含量，考察植物复合酶的酶解时间、酶解温度对传统提取工艺的强化效果，通过显微结构图和红外光谱图说明了复合酶法强化传统提取法的作用方式及提取物的结构。结果表明酶用量为0.4%时，可提高远志总皂普提取率、缩短提取时间、减少乙醇使用量，这对于远志流浸膏的高效提取具有一定指导意义。另外，刘国际等［14］以复合酶法提取薯蓣皂苷元，结果发现，复合酶法较其他酶法具有一定优势。且本实验所选用的酶为粗制品，价格廉价，有助于薯蓣皂苷元大规模化生产。张明春等［15］以水提工艺为对照，研究了纤维素酶与果胶酶复合酶法提取酸枣仁黄酮新工艺。结果发现，在纤维素酶与果胶酶比为1∶1.30U/g酸枣仁时提取。该工艺的酸枣仁黄酮提取率比传统水提工艺提高了54.67%。张明［16］以山东大青叶为材料，以复合酶水解、乙醇沉淀法提取其中的多糖。通过正交试验，结果发现在纤维素酶1.5%、果胶酶2.0%、胰蛋白酶1.5%的条件下大青叶多糖的平均得率可高达18.24%。

3.4 转苷酶法转苷酶是葡萄糖苷转移酶的简称，转苷酶法在中药提取与啤酒发酵等已有应用并显示了明显的优势。许明淑等［17］以银杏叶为原料，利用 Suhong475转苷酶将黄酮苷元转为黄酮苷以提高其水溶性，再以低浓度的乙醇溶液提取，结果表明，总黄酮的提取率比未加酶的对照组增加了44%。其实，早在上世纪90年代，日本学者高根芳春就已采用转苷酶对黄酮苷元进行提取，通过糖基转移获得了更高活性、更便于人体吸收利用的银杏叶的有效成分槲皮素苷，使其黄酮提取率从原先的0.22%提升为0.38%。另外，转苷酶法还有更广泛的应用，如李峰等［18］用跳跃式糖化与加转苷酶相结合的方法，生产出了更加优质的低醇啤酒。

3.5 超声―酶法贲永光等［19］以黄芪饮片为原料，结合单因素实验，采用超声―酶法提取黄芪总多糖，并通过正交试验优化其提取工艺。结果发现，在超声提取时间30min、酶量10mg等条件下，黄芪多糖的提取率为24.2%，较传统水提工艺有明显提高。陶涛等［20］以九华山黄精为原料，水为提取溶剂，采用超声波协同纤维素酶方法对其多糖和皂苷进行综合提取。通过单因素和正交试验研究，结果发现，在纤维素酶与底物质量比为1%时，多糖和皂苷提取率分别是39.36%和11.69%。相比传统提取方法，多糖和皂苷的提取率均有了提高。另外，徐艳等［21］研究超声―酶法在黄柏的小檗碱提取中的应用效果，同样采用单因素实验和正交实验，结果发现在超声功率为80%、加酶25mL时黄柏小檗碱的提取率高，且具有高效、节能等优势。周琳等［22］研究报道了超声―酶法提取三七总皂苷，以三七提取液中总皂苷的含量和提取物得率为指标，并采用四因素、三水平正交设计法，结果发现在纤维素酶与果胶酶用量比为3∶28时，三七提取液中总皂苷得率高达35.17%。