植物多聚半乳糖醛酸酶研究进展

陈丽萍 韩明丽 赵 根 李艳冬

（浙江省湖州市农业科学研究院 313000）

多聚半乳糖醛酸（内切）酶（Polygalacturonase，EC，3.2.1.15， 简称 PG 或 endo-PG）是多聚-α-1，4-半乳糖醛酸聚糖水化酶 （poly-galacturonideglycanohydrase）的通用名，是可分解果胶或果胶酸酶类中的一种，亦称果胶酶（pectic enzyme）或果胶解聚酶（pectin depolymerase）。PG是一种细胞壁结构蛋白，可以催化果胶分子多聚α-（1，4）-聚半乳糖醛酸的裂解，参与果胶的降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化。而PG的多基因家族成员在植物发育不同阶段和不同组织中的表达与果实成熟、细胞分离过程（如叶和花的脱落、豆荚开裂、花粉成熟、病原物防御、植物寄主互作）有关，还与细胞伸展、发育和木质化有关。由于PG基因在果实成熟软化中所起的作用不是很清楚，已成为国内研究的热点与难点。

1 多聚半乳糖醛酸酶的作用方式

早在1965年，Hobson用细胞壁蛋白粗提液体外降解纯化果胶的方法发现了果实软化与PG活性的相关性，并将PG按作用方式分为内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）、外切多聚半乳糖醛酸酶（exo-PG）和寡聚半乳糖醛酸酶（oligo-PG）。前者以内切方式水解断裂多聚半乳糖醛酸链，后二者以外切方式依次从半乳糖醛酸多聚链或寡聚链的非还原端释放出一个单体或一个二聚体。Endo-PG对底物的特异性较强，exo-PG则较弱。Tieman等应用免疫定位法检测整个番茄果实中的PG蛋白，发现PG的积累首先出现于心皮到果实中柱的这部分组织中，其次出现于果皮组织和其辐射状细胞的细胞壁中，在时间上PG的积累和茄红素的积累同步，PG蛋白大多存在于细胞壁间层或初生壁，少量定位于细胞质膜上。另外，PG也在果实、叶和花脱落区，豆荚、花药、花粉粒、花粉管及快速生长组织中被检出，表明PG参与植物发育的许多过程。

有人认为番茄硬度下降与PG活性有密切关系，即PG含量越高，果实硬度越小，果实软化程度越高。目前已从多种作物果实中克隆获得了多聚半乳糖醛酸酶基因，陈儒钢等从辣椒中分离克隆出果实多聚半乳糖醛酸酶基因CaPG，序列分析表明，该基因全长 cDNA 为 1668bp，5’编码区为 119bp，3’编码区为442bp，CDS长1107bp，编码368个氨基酸，聚类分析表明该基因与番茄的亲缘关系较近，该基因可能与番茄中的PG基因具有相似的作用。

2 多聚半乳糖醛酸酶的同工酶

PG已在许多植物果实中被分离纯化，已经从番茄、桃、苹果、梨、香蕉、李、杏、葡萄、草莓、鳄梨、柿、橙、番木瓜等果实中分离出了大量与果实成熟软化相关的PG基因（NCBI数据）。番茄、香蕉和草莓都有3种不同的同工酶，番茄和香蕉是一种同工酶在行使外-PG的功能，两种行使内-PG的功能，而草莓则相反。Tucker等在最早时研究番茄PG时发现共有2种同工酶，分别是PG1和PG2。PG1分子量较大，为115kd，等电点为8.6，热稳定性较好，出现于果实成熟的早期阶段。Brady等后又发现，随着果实的成熟，出现2种分子量较小的同工酶，即PG2a和PG2b，分子量分别为43kd和46kd，其等电点均为9.4。以后的研究证实PG2a和PG2b是同一基因的产物，其差异只在于糖苷化的程度不同。这3种同工酶均为糖蛋白，PG蛋白的SDS变性及蛋白酶消化反应、免疫交叉反应表明了PG1是PG2a或PG2b与其它亚单位的非共价复合体。Giovannoni等证明了这3种同工酶在DNA水平上源自于同一PG基因组。PG1、PG2a和PG2b在果实成熟中出现的顺序不一样，PG1在成熟的早期占优势，而在完全成熟中则是PG2a和PG2b占绝对优势。β-亚基位由一单基因编码，并且只能在果实组织中表达，其mRNA在果实成熟启动前几天急剧增加并达到最大含量。β-亚单位定位于果皮的细胞壁，刺激对底物的作用能力。

3 多聚半乳糖醛酸酶基因

PG是由多基因家族编码的，Kalaitzis等在番茄衰老的叶和花中获得3个PG cDNA，分别为TAPG1、TAPG2和TAPG4。它们间的同源性为76%～93%，但是它们与果实中PG的同源性仅为38%～41%。在果实、茎、叶柄和花药中未发现它们的表达，而且TAPG4比TAPG1和TAPG2转录的早。Kristena等报道，在瓜类果实中有PG介导的果胶物质的分解，它们获得了3个 PGcDNA， 为 MPG1、MPG2和 MPG3。 MPG1和MPG2与桃和番茄衰老区PGs有关联，MPG3与番茄果实PG有关联。

目前已被克隆的果实PG基因大小约7kb，包含8个内含子，其大小从99bp到953bp不等，调控基因表达的顺式作用因子存在于PG基因的上游非编码区，转录单位的5’末端的一个1.4kb片段直接参与了成熟特异基因的表达。所有被克隆的PG基因编码的PG，N端都有一个疏水信号序列，引导PG蛋白进入内质网网腔和定位于细胞壁。番茄PG蛋白经历了广泛的共翻译和后翻译调节，包括疏水的N端信号序列的加工、前肽的加工、不同的糖基化和C端的加工而成。

在番茄中已确定了7个多聚半乳糖醛酸酶基因，即：TAPG1、TAPG2、TAPG3、TAPG4、TAPG5、TAPG6与TAPG7，并且在离区与果实中表达的基因并不相同。各基因家族成员分别调节不同的时空表达，不同的PG基因家族成员编码的酶存在生物学性质上的差异，如分解特异性和基质特异性，其氨基酸顺序也存在较大的差异性，如调控番茄成熟的PG氨基酸序列和甜瓜果实PG只有60%同源。但从植物克隆得到的序列来看，PG还是存在一些高度保守的区域，经过序列比对发现来自不同物种的PG基因的氨基酸序列同源性较高，含有4个保守性极强的基序（motif）： ‘S294PNTDGIH301’， ‘G318DDC321’，‘C338GPGHG343’和‘R376IK378’。 大多数半胱氨酸（Cys，C）位点具有较强的保守性，然而3个进化支中的PG蛋白还有各自的保守区域和各自保守的半胱氨酸。酶的催化功能可能归功于这一区域高度保守的残基。

4 多聚半乳糖醛酸酶基因表达的分子调控

目前通过分子水平调控PG基因的表达有两种方法。一种是通过反义RNA技术对PG进行负调控。Smith等将PG cDNA 5’端的730bp片段反向插入接上CaMV35启动子和Nos基因3’末端，构建了一个反义融合基因，将其导入Binl9后再转入农杆菌LBA4404，用来转化番茄茎段，在叶中和果中都发现了反义PG cDNA，其果实PG活性只有正常株的10%。Sheehy等用PG cDNA长度为1600bp的包含有PG开放阅读框架的片段也构建了反义基因，得到的纯台体果实，成熟各阶段的mRNA和PG的水平也大大降低。另一种方法是通过插入失活使PG基因不能表达。Cooley等用位点选择性插入的方法（the siteselected insertion）在番茄PG基因中产生插入突变，这种插入突变能遗传给后代，所用的插入诱变物为转座子元件在得到的纯台系后代植株的果实中，PG的活性至少降低了99.9%（用粘度法表示酶活性）。这种插入突变较反义技术抑制基因的表达为优，因为插入突变可以使目标基因完全失活，多基因家族的多基因拷贝可以独立突变，而且通过转座子元件的切除所引起的序列改变能产生新的等位基因和表现型。Cooley等同时应用单链构象多态性（SSCP）发现产生切除足印等位基因（excision footprint alle1），这种切除足迹（excision footprint allel）能在含有PG信息的框架内产生一个终止密码子，从而使纯台型的果实中PG活性显著降低。这样在PG中就不含转基因物质，应用这种方法进行植物基因工程改造具有极高的商业价值。

5 多聚半乳糖醛酸酶与植物激素的关系

果实采收后仍是一个活的有机体，有机体内细胞之间及细胞内各细胞器之间相互联系是其生命活动必不可少的条件。这些联系是通过各种信使系统来完成的，植物激素是细胞之间的第一信使，它在果实衰老进程中起着重要的调控作用。

5.1 乙烯对多聚半乳糖醛酸酶的影响

乙烯是一种成熟衰老激素，它在果实的采后成熟、衰老进程中起重要的调控作用。许多研究结果表明，PG基因的表达是受乙烯调控的，乙烯可以诱导绿熟番茄PGmRNA的积累。在不能正常成熟、乙烯合成受阻的突变体番茄Nr中，PGmRNA和PG酶的水平极低，乙烯合成抑制剂也可以抑制PGmRNA的积累；番茄中E4和E8基因是受乙烯调控的，其启动子中具有乙烯应答元件，而PG基因的启动子也具有与这些乙烯应答元件相似的序列。但在反义ACC和反义EFE转基因番茄的果实中，即使乙烯合成受到抑制，PGmRNA仍大量积累，但PG酶不会积累，表明mRNA的转录不受乙烯调控，乙烯只是控制PGmRNA的翻译和多肽的稳定性。Theologis等认为，与成熟相关基因的表达受两个独立的途径调控：一种不依赖乙烯，受阶段调控；另一种依赖乙烯，PGmRNA的转录不需乙烯，而PG的翻译是受乙烯调控的。

5.2 其它几种植物激素

在果实成熟衰老过程中，ABA也起着重要的调控作用。周玉婵等用5mg/L ABA处理芒果果实，贮藏期间果实的PG酶活性增高，软化加快，ABA处理可能直接促进了PG酶活性的增加。外源ABA处理能够刺激越变前果实的乙烯生成，表明内源或外源ABA也可能间接地发挥着乙烯的作用，促进果实成熟软化。

多胺对PG酶活性也有一定影响。苹果经多胺处理后，PG酶活性被显著地抑制，硬度增加，然后缓慢下降，其下降进程明显减慢，其中以精胺处理的抑制效果最为明显。芒果经多胺处理也得到了同样的结果。多胺和乙烯相互竞争共同的前体物质SAM，多胺延缓果实的后熟软化很可能是通过抑制乙烯合成而间接抑制PG酶的活性来实现的。生长素、赤霉素和细胞分裂素对PG酶活性的调控作用研究很多。芒果经5mg/L GA处理后，贮藏期间PG酶活性峰比对照推迟3d出现，且峰值较低，果实的成熟软化受阻。

6 多聚半乳糖醛酸酶功能的多样性

PG蛋白于35年前被首次分离并被认为参与植物发育许多阶段的果胶降解，尤其是那些需要细胞分化的阶段。虽然PG参与植物发育的许多过程，但多数研究集中在果实成熟、离层区和花粉上。

6.1 与果胶的降解的关系

果胶是植物细胞壁的主要成分之一，主要存在于中胶层，初生壁中也有一部分，它与半纤维素一起组成共同伸展的网络状结构，纤维素微纤丝镶嵌在其中，这是Carpita等提出的植物初生壁模型，果胶分子的主要特征是由α-（1、4）连接的D-半乳糖醛酸的羧基发生了甲基酯化，有的在线状主链上插入一些鼠李糖单位，这些鼠李糖残基上常常由富含阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的侧链。果胶网络结构发生系统性分解，因此果胶代谢在植物发育过程中具有重要的作用。

果实的软化是细胞分离的结果。细胞分离是由胞间层结构改变、细胞壁总体结构破坏以及胞壁物质降解引起的。在果实的软化期间果胶和半纤维素都发生了溶解和去聚化，被认为与细胞壁的松懈及降解有关。PGs在细胞壁结构的改变中起重要作用，它可以催化果胶分子番茄果实中α-（1、4）-聚半乳糖醛酸的裂解，从而参与果胶的降解，促进果实软化，有以下几个方面的证据。果实的软化进程与PGs活性增高一致。许多果实在成熟软化过程中PGs活性都很高，这表明了果实的软化和果胶的降解呈很好的相关性；在体外实验中，PGs能直接水解未成熟果实中分离得到的细胞壁材料；未成熟果实的果皮组织用PG酶液处理时，其超微结构的变化与成熟时一样；果实不能正常成熟和软化的突变体（rin，nor）都缺乏PG。虽然PG在果实的软化中起重要作用，但许多实验表明，PGs对于果实成熟软化并不是必要的。

6.2 与器官脱落的关系

在植物生长发育过程中，器官都会经历程序性衰老，也会从亲本上脱落下来。脱落受发育程序控制器官分离断裂，是细胞壁和中胶层在离层处破裂的结果。在产生离层过程中，果胶被溶解，中间层膨大、开孔并消失，微纤丝网络与器官分开。细胞壁降解酶系统是导致植物离区细胞发生分离的主要原因，其中的PG是植物离区重要水解酶之一，其活性的升高与离区脱落进程中强度的降低相一致，并且位于细胞发生分离的部位。

目前，在番茄中已明确了TAPG1、TAPG2、TAPG4和TAPG5在乙烯诱导的叶片和花柄脱落区中表达，但这些基因的表达非常复杂，现仍未明确在番茄花柄脱落中起决定作用的基因。豆荚的裂开和花药的开裂都与脱落相似，虽然在裂开区未能肯定有PG活性，但已鉴定到到编码假定裂开区专化表达PG的cDNA，说明PG对豆荚的裂开起作用。

6.3 与植物授粉的关系

在许多物种（包括玉米、草本植物和大量的木本树）的花粉中具有高水平的外切PG活性。花粉管PG通过作用于花粉管壁而加速生长，可能exo-PG通过修饰不具活性的低聚半乳糖苷信号分子成为具活性的低聚体而引导花粉管通向子房。许多基因在花粉中表达，目前已从多种植物分离到花粉专一的基因。除看家基因外，根据其在有丝分裂前或后表达分成两类：早期基因编码的蛋白主要是细胞骨架蛋白以及与细胞壁合成、淀粉积累有关的蛋白；而后期基因可能编码花粉成熟和花粉管生长的蛋白。玉米、烟草、甘蓝型油菜和其它物种上与PG有同源序列的cDNA已被鉴定，并被归为后期基因。

6.4 与病害发生的关系

多聚半乳糖醛酸酶是降解植物细胞壁果胶的主要酶之一，在植物病原真菌的致病性中起着重要的作用。在许多真菌中已经证实多聚半乳糖醛酸酶的缺失或失活会导致致病力下降，但是在有些真菌中多聚半乳糖醛酸酶基因的失活并不直接影响致病力，可能与多聚半乳糖醛酸酶在真菌基因组中往往是以多基因家族存在，并且有些基因还是多拷贝的或者具有多种翻译后修饰有关。转反义PG基因番茄果实抗病性提高，进而提高其商品价值。转反义PG基因番茄果实的这个性质，主要是由于PG活性被很大程度地抑制，果胶降解减慢，较好地维持了果实细胞壁结构，使病原微生物不易侵入果实，从而增强抗病性。