胃食管反流病相关的细胞间隙增宽和紧密连接蛋白*

谭佳成 叶必星 林 琳

南京医科大学第一附属医院消化科(210029)

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)系指胃内容物反流入食管，引起不适症状和(或)并发症的一种疾病。GERD分为糜烂性食管炎(erosive esophagitis，EE)、非糜烂性反流病(non-erosive reflux disease，NERD)和Barrett食管(Barrett’s esophagus，BE)。抗反流屏障功能障碍在GERD的发病机制中起重要作用，包括下食管括约肌松弛、食管反流物清除障碍、食管黏膜防御能力下降等［1］。其中食管黏膜防御功能主要由上皮屏障完成，包括上皮细胞膜和紧密连接(tight junction，TJ)。有研究发现，GERD患者食管上皮TJ蛋白表达和分布异常可导致上皮细胞间隙增宽(dilated intercellular spaces，DIS)，可能成为GERD食管形态结构异常的客观指标［2，3］。本文就TJ蛋白、DIS与GERD的关系作一综述。

一、TJ组成

TJ是细胞与细胞间连接的重要形式，是一系列跨膜蛋白与外周蛋白相互作用形成的复杂蛋白质体系，由多种信号调控。TJ是构成上皮机械屏障最重要的结构，由occludin蛋白、claudin蛋白、胞质紧密黏连蛋白(zonula occludens，ZOs)、连接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)等结构蛋白和各类连接蛋白共同组成［4］。上皮细胞屏障功能损伤与TJ复合物的解离或缺失有关［5］。

Occludin是TJ的重要结构成分，彼此间相互作用，亦可与ZOs发生联系，然后间接与肌动蛋白和JAMs相互作用，构成上皮完整的 TJ［6］。免疫电镜显示，occludin定位于TJ，不仅通过细胞外结构域在相邻细胞间以“拉链”的方式结合，进而严密封闭细胞旁间隙;还可通过与该区域其他TJ蛋白结合，参与 TJ的信号调节［7］。

Claudin在相邻细胞间以“拉链”状相互结合产生细胞旁封闭。目前在哺乳动物中已发现24种claudin超家族成员。claudin分子上存在与支架蛋白ZO-1结合的关键位点，通过ZO-1将自身固定于细胞骨架，参与细胞旁通透性的调节。目前对claudin-1的研究较多，其是TJ的主要功能蛋白，对维持上皮细胞屏障以及TJ的完整性具有重要作用［8～10］。

ZOs是TJ的支架蛋白，位于细胞内膜表面，与绝大多数膜TJ蛋白以及细胞骨架相连。ZOs属膜相关鸟苷酸激酶(MAGUK)家族，包括 ZO-1、ZO-2 和 ZO-3 三个异构体［11］，其蛋白结构相似，均含特殊的亮氨酸锌指样结构。目前研究较多的是ZO-1，其分子质量为225 kDa(1 Da=0.9921 u)，包含3个PDZ(PSD-95、Dlg和ZO-1)结构域、1个SH3结构域、1个GUK结构域的氨基端和连接到肌动蛋白的羧基端［11］。

JAMs是一类Ca2+非依赖性的免疫球蛋白，具有2个胞外Ig结构域和1个含PDZ结合区的胞浆结构域以及多个磷酸化位点［12］。JAMs主要表达于内皮/上皮细胞的TJ，亦可见于血循环白细胞和血小板［13］。JAMs不同的分子含有不同的功能域，借助其在亚细胞结构上的不同定位、对多种配体的不同亲和力，发挥重要生物学功能。有学者认为，JAMs有调节细胞极性、通透性和维持细胞形态的多重功能［14］。

总之，跨膜蛋白occludin和claudin均含有支架蛋白ZO-1的结合位点，从而固定于细胞骨架，使相邻细胞以“拉链”形式连接细胞并产生细胞旁封闭，共同形成TJ的结构基础;occludin还能间接与肌动蛋白和JAMs发生作用。这些结构蛋白和连接蛋白组成了复杂的蛋白连接体系，共同维持食管黏膜屏障的完整性。

二、GERD中TJ蛋白的研究

以往对TJ蛋白的研究主要集中于炎症性肠病、胰腺炎、肝脏疾病、恶性肿瘤等，近年对GERD食管黏膜中TJ蛋白的研究逐渐增多。Asaoka等［15］报道，反流性食管炎(RE)模型大鼠食管黏膜棘层和颗粒层糜烂附近的细胞膜和细胞质中claudin-1表达增加，而claudin-4和occludin表达由细胞膜转入细胞质，claudin-3表达明显下降;这些TJ改变明显影响了食管上皮细胞的通透性。Oguro等［16］发现，胃酸可诱导RE模型大鼠claudin-3从食管上皮细胞膜进入胞质，使TJ复合物稳定性下降，这可作为RE炎症和修复过程最特异、最敏感的指标之一，有必要在临床上检测正常食管和RE食管黏膜中claudin的变化。另有研究［17］显示，RE大鼠食管黏膜中 claudin-1、occludin、ZO-1、JAMs表达较对照组均明显增高，但在单个食管上皮细胞中，上述蛋白表达减少，推测RE时TJ蛋白变化的分子机制为持续存在的食管损伤因素引起食管上皮局部细胞增殖，新增殖细胞间的TJ蛋白重新构建，当新的TJ蛋白构建速度慢于细胞增殖速度时，上述蛋白的调节发生障碍，即出现单个细胞TJ蛋白表达下降等现象。由于反流物破坏了食管黏膜claudin-1和occludin结构，ZO-1不能将claudin-1连接到细胞膜，导致TJ复合体结构的破坏，食管上皮细胞通透性增加，引起RE。

三、DIS与GERD

Hopwood等［18］首次报道了GERD患者食管上皮存在DIS。随后大量研究均证实，GERD患者(包括NERD和EE)食管上皮普遍存在 DIS、细胞旁通透性增加［2，3，19］。Tobey等［20］发现，非糜烂性酸暴露引起的食管上皮DIS不仅与跨上皮电阻降低和细胞旁通透性增加有关，而且可作为酸暴露损伤食管的标记。分子质量为20 kDa的葡聚糖分子能弥散透过食管上皮层，证实了酸或酸化胃蛋白酶引起的细胞旁通透性增加是客观存在的。越来越多的研究证实，DIS是食管上皮细胞连接破坏的标记，亦是细胞旁通透性增加的标记。

目前，DIS是GERD/EE的重要形态学特征这一观点已被广泛接受，采用光镜或电镜可对GERD/EE患者下段食管鳞状上皮细胞的DIS进行定量研究，或许可作为诊断、治疗和随访的一种形态学标记［3］。

DIS可由酸反流引起，心理应激和胆汁酸反流亦可诱导DIS发生或持续存在。DIS使食管上皮对酸的通透性增加，酸弥散至黏膜层，引起炎症细胞浸润，这或许是GERD患者发生食管黏膜炎症和烧心症状的机制［21］。Tadiparthi等［22］的研究发现，DIS与RE患者的症状密切相关，但与NERD患者的症状尚无明显关联;说明RE和NERD的发病机制可能不同，并可解释这两类患者在接受抑酸治疗后的症状缓解率不同。

质子泵抑制剂(PPI)可能有助于改善GERD患者食管上皮DIS。Calabrese等［23］的研究结果显示，PPI治疗3个月和6个月可分别使92.1%和97.4%的GERD患者食管上皮DIS完全消失，其中NERD患者和RE患者的DIS改善情况无明显差异;DIS消失者的烧心症状均缓解。

四、TJ蛋白与DIS

食管黏膜的通透性取决于细胞通路(主要为胞膜)和细胞旁通路(主要为TJ)的完整性。在NERD动物模型中，将食管黏膜暴露于酸或酸化的胃蛋白酶环境中，会使TJ复合物破坏，从而造成细胞旁通路对水、电解质和小分子物质的通透性增加，导致食管鳞状上皮出现DIS［24］。

Farré等［25］的研究发现，将食管黏膜短暂暴露于胆酸会引起食管上皮细胞TJ结构破坏，上皮屏障的完整性受损，进而引起DIS，这可能是部分GERD患者使用PPI治疗后，症状仍持续存在的原因之一。Asaoka等［15］发现，RE时TJ蛋白表达和分布发生变化，这些改变可能导致了细胞旁通透性增加。最近一项研究［26］亦发现，酸、胆汁酸和胃蛋白酶均可通过调节食管上皮细胞TJ蛋白，破坏食管上皮屏障，使上皮细胞的通透性增加。

目前普遍认为，GERD患者由于食管上皮TJ结构和功能异常，细胞通透性增加并出现DIS，使H+、胃蛋白酶、胆汁酸等逆行弥散进入上皮层，损害食管黏膜，并通过食管黏膜内的瞬时受体电位香草酸亚型(TRPV)和酸敏感离子通道(ASIC)产生GERD的临床症状［27］。

五、结语

GERD的发生机制已探讨数十年。近年研究发现GERD患者的食管上皮存在TJ结构和功能的异常(细胞旁通透性增加，进而出现DIS)，可能与GERD的发生有关。但TJ蛋白与DIS的关系、NERD和EE患者症状与DIS的关系等仍需进一步研究。明确这些问题将为GERD的诊断、治疗甚至疗效评估提供新的方向。

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