RNAi在大肠癌基因治疗中的研究现状

陶亮，茆家定综述，吴佩审校

(芜湖市皖南医学院弋矶山医院胃肠二科，安徽芜湖 241000)

目前大肠癌 (colorectal cancer)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年增高趋势。大肠癌的发病过程是多步骤、多阶段的，受遗传和内外环境等因素的作用［1］。传统治疗方法是以手术治疗为主，同时辅以化疗、放疗的治疗方案，虽然对Ⅰ期和Ⅱ期大肠癌有一定疗效，但仍有大量的患者失去手术机会，而术后化疗和放疗对肿瘤非特异性，且敏感性差，副作用大，效果欠佳。因此迫切需要寻找到一条特异性高的诊断方法和有效的治疗途径。RNAi是近年来发展起来的一项新技术，是由外源或内源性的双链RNA(dsRNA)导入细胞而引起同源的mRNA降解，进而抑制其相应的基因表达。它具有特异、高效等突出优点，现已被广泛用于大肠癌基因治疗方面的研究与探索。

1 RNAi概述

在1998年，美国学者Fire A等研究人员向线虫体内注入由正义链和反义链混合的dsRNA，出现了基因沉默现象(gene silencing)，随后Fire将这一系列特异性基因沉默现象称之为RNAi。过去十几年间学者们发现RNAi现象广泛地存在于真核细胞中［2］。RNAi小分子也由最初的双链RNAi，发展到现今的Small interfering RNA(siRNA)、Short hairpinRNA(shRNA)、piwi－interating RNA(piRNA)、Micro RNA(miRNA)等。RNAi的出现为医学基础研究提供了新的思路及方法，并用于某些肿瘤、病毒感染性疾病治疗的研究中［3］。

1.1 RNAi的作用的基本原理 RNAi的作用机制尚未明确，目前普遍认为RNAi可分为两个阶段:

起始阶段:当病毒基因等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用该基因组进行转录产生少许dsRNA及shRNA，再经RNaseⅢ家族的 Dicer核酸内切酶切割成长度为20－25bp的siRNA，siRNA被RNA解旋酶解链成正义链和反义链，其中的反义链与相关酶 (包括外切酶等)结合后形成RNA沉默的复合物 (RNA induced silencing complex，RISC)。

效应阶段:随后携带siRNA反义链的RISC与目的基因的mRNA的互补序列特异性结合并切割结合部位两端mRNA，断裂的mRNA随即降解，从而导致特定基因沉默。另外细胞基因组本身所产生的miRNA，经一系列酶 (如Dicer酶、聚合酶等)作用后与相应的靶mRNA结合，抑制其翻译，从而抑制基因表达［4－5］。

1.2 RNAi的特点 RNAi具有以下几个点特点:(1)特异性:siRNA的反义链与对应基因mRNA互补配对，碱基序列具有高度的特异性;(2)高效性:仅需少量的dsRNA以催化放大方式产生大量的siRNA，从而有效抑制靶基因的表达;(3)长度依赖性:长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21个bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割;(4)可传播性:siRNA可在RNA依赖性RNA酶(RdRP)的作用下大量扩增，并转运出细胞，在不同细胞问长距离传递和维持，使RNAi扩散到整个机体并可以传代;(5)ATP依赖性:siRNA整个作用过程中有酶参与的步骤均消耗ATP，在去除ATP的样品中RNAi现象降低或消失［6－7］。

2 RNAi在大肠癌诊疗中的研究

2.1 RNAi在大肠癌细胞增殖的研究 大肠癌的发生过程是多步骤、多阶段的，主要与人体内抗凋亡基因的异常激活等因素有关。而抗凋亡基因的激活可导致凋亡抑制蛋白的高表达，从而抑制肿瘤细胞的增长。而RNAi可特异性的抑制某些基因的表达，所以利用RNAi封闭那些和大肠癌有关的基因从而抑制大肠癌细胞的生长，达到治疗大肠癌的目的。

凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosisprotein，IAP)家族为一类抗凋亡基因表达产物，其中人体凋亡抑制蛋白是抑制细胞凋亡的重要成分，这一蛋白家族抑制细胞凋亡的作用在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，目前该家族已发现有Survivin、Livin等重要成员［8］。研究表明Survivin基因是人们认识的最强凋亡抑制基因，该基因只在肿瘤组织中表达，而在正常分化的组织中几乎无表达［9］。Gazouli发现Survivin基因在大肠癌组织中高表达，其下游蛋白能抑制大肠癌细胞凋亡，促进大肠癌细胞的增殖［10］。Wang等通过通过cDNA技术构建Survivin的shRNA并转导入大肠癌SW480细胞，Western blot检测细胞内Survivin蛋白的表达水平降低，检测实验组细胞生长速度减慢多停滞于G2/M期［11］。Livin亦为IAP家族的一员，同样在大肠癌组织中高度表达，在正常组织中几乎无表达［12］。Bo－Young等构建Livin的siRNA载体转染至大肠癌细胞，并使用RT－PCR检测大肠癌细胞mRNA水平变化，流式细胞仪检测转染siRNA组大肠癌细胞生长明显抑制，凋亡率显著增加，RT－PCR显示Livin mRNA表达显著低于对照组［13］。STATs尤其是STAT3在多种肿瘸中表达均明显增高，其表达强度与肿瘤的生长、转移及预后等有关。STAT3被激活后可抑制免疫细胞对机体肿瘤细胞的监视，导致肿瘤细胞的异常增殖［14］。尼克酰胺－N－甲基化酶 (NNMT)是近来研究发现，其与多种肿瘤关系密切，在结直肠癌等多种肿瘤组织中存在高表达［15］，NNMT的高表达则受到STAT3等因子激活。Bedel通过构建了siRNA－STAT3转染至大肠癌细胞HT－29中，使得NNMT表达受到抑制从而诱发了肿瘤细胞的凋亡［16］。研究发c－FLIP在抑制细胞凋亡、促进肿瘤细胞发生发展等方面发挥着重要作用［17］。Shen等构建了pFLAG－CMV－FLIP质粒并转染入结肠癌HT－29细胞，可显著降低FLIP基因mRNA的表达水平，并提高HT－29细胞对Fas介导的凋亡敏感性［18］。利用RNAi技术沉默上述有关凋亡抑制蛋白的基因，抑制大肠癌细胞的增殖，促进大肠癌细胞的凋亡，可能成为治疗大肠癌基因治疗的新方向，并且上述基因在肿瘤中高表达，而在正常组织中几乎不表达，这种特异性可能会成为往后肿瘤诊断的新方法。

国外研究临床研究证实长期服用非甾体抗炎药(NSAIDs)能降低大肠癌的发生率［19］。随后研究发现环氧化酶－2(COX－2)在炎性介质、生长因子等刺激啊下表达，而COX－2的产物前列腺素E2(PGE2)能够刺激肿瘤的生长，抑制肿瘤细胞凋亡［20］。并有学者证实COX－2的表达与大肠癌细胞的增殖，肿瘤分期密切相关［21］。将COX－2抑制剂与常规化疗药物联合应用于大肠癌的治疗中取得了不错的效果［22］，但是随后人们发现COX－2抑制剂的副作用会造成患者心脑血管病变，学者开始寻找高效、低毒的途径抑制COX－2的表达。Sansone等通过瞬时转染特异性siRNA后干扰大肠癌细胞HT－29中COX－2变化，随后通过MTT和流式细胞分析仪检测实验组细胞增殖活性明显受抑制，细胞生长明显减缓，RT－PCR检测实验组mRNA水平较对照组明显下降［23］。利用RNAi技术特异性抑制大肠癌细胞中的COX－2，可能给大肠癌基因治疗提供新的靶点。

2.2 RNAi在抑制大肠癌细胞的侵袭 粘着斑激酶 (focal adhesion kinase，FAK)作为胞内重要的信号分子，介导细胞内信号网络系统的交联，在大肠癌细胞的移动和侵袭中起关键的作用［24］。Shahzad构建 FAK siRNA并应用纳米rHDL转染结肠癌HT116细胞，FAK干扰组较未处理组及阴性对照组FAK的表达明显降低，干扰组细胞生长抑制 (P＜0.05)［25］。黏附分子CD44与纤维蛋白等结合，介导细胞与细胞、细胞与基质间特异性黏附过程，与大肠癌的转移关系密切，一定程度上促进了大肠癌的转移［26］。Subramaniam等用siRNA下调结肠癌HT－29细胞CD44表达水平，能够增加肌动蛋白结合蛋白的表达水平，从而改变结肠癌细胞的定向运动，阻止肿瘤侵袭［27］。血管内皮生长因子(VEGF)是肿瘤血管及淋巴管生成过程中作用最强的调控因子，它能刺激内皮细胞增殖并阻止新生管腔退化，新生的血管及淋巴管有利于肿瘤细胞的转移，影响肿瘤的预后［28］。已有研究表明VEGF在大肠癌组织中较癌旁及正常组织中表达明显增高［29］。YU构建siRNA－VEGF质粒转染大肠癌细胞株HT116后，靶基因VEGFmRNA表达下降，同时相关蛋白减少，从而抑制了大肠癌细胞的增殖活性，诱导细胞出现凋亡，同时肿瘤细胞的侵袭特性降低［30］。

因此，在大肠癌的治疗中，FAK、CD44、VEGF可以成为有效的基因治疗靶点，以及作为预测肿瘤复发、转移的指标，为进一步研究利用RNAi技术抑制肿瘤侵袭及转移奠定了一定的理论基础，为肿瘤分子生物学治疗提供了新思路。

3 结 论

RNAi现象的发现及其分子生物学机制和功能的初步阐明，为各种疾病的基因治疗提供了理论基础。现已广泛应用于大肠癌的发病机制及基因治疗的研究中，但目前仍限于体外实验和动物实验研究阶段，作为有效的基因治疗方法应用于临床还需要继续深入的研究。RNAi在寻找对抗大肠癌转移的途径，探寻遗传性大肠癌的基因缺陷及研究大肠癌的肿瘤疫苗等方面还有进一步探索研究的空间。因此，RNAi技术隐藏着巨大的应用前景，值得进一步研究和探索。

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