高氧诱导的急性肺损伤研究现状及治疗靶点

方以群，张 懿

氧气对于细胞的代谢和能量产生有着非常重要的作用，但过多的吸入氧气也会给机体带来毒性作用。新生儿长期氧疗可能出现视网膜病变，导致支气管肺泡发育不良。潜水时长时间吸入高分压氧、应用高压氧治疗减压病时，也会导致氧中毒的发生。氧气的毒性作用在于体内线粒体代谢氧气的过程中所产生的活性氧族(reactive oxygen species，ROS)。ROS能够损伤细胞中的小分子如DNA、RNA、蛋白质和脂类等，通过调节转录因子和靶基因的激活导致细胞的凋亡或坏死。

肺是最早接触氧气的部位，因此是氧中毒的主要损伤靶器官之一。高氧能够诱导肺内的炎症反应、肺泡-毛细血管屏障破坏、气体交换障碍和肺水肿[1]。

1 高氧诱导急性肺损伤的分子机制

研究证实，ROS的过度产生和大量炎症细胞募集入肺是高氧诱导急性肺损伤的主要损伤机制[2]。

高氧条件下，ROS产生的主要部位是线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶[3]。募集入肺的大量炎症细胞所释放的ROS是导致氧中毒肺损伤的主要来源，而炎症细胞产生的ROS则完全来源于NADPH氧化酶系统。除了炎症细胞通过NADPH氧化酶产生ROS，内皮细胞也能利用自身的NADPH氧化酶系统产生ROS，诱导内皮屏障的破坏[4]。

在促炎症因子和趋化因子的作用下，大量的炎症细胞募集入肺，除了破坏内皮屏障，炎症细胞还释放大量的蛋白酶和可溶性物质[5]，进一步加重肺内的炎症反应和肺泡上皮细胞损伤，诱导多条信号转导通路和多种转录因子的激活。

因而，减少ROS的产生，减轻肺内的炎症反应以及调节信号转导通路和转录因子的活性是氧中毒肺损伤中的重要治疗靶点。

2 减少ROS的过度产生

炎症细胞通过NADPH氧化酶系统所产生的ROS是氧中毒肺损伤的主要来源。线粒体通透性转运孔组成蛋白环孢素受体D(可使细胞免受钙超载和氧化应激损伤)的缺失并不能减轻高氧所诱导的肺损伤[6]，所以相对于线粒体途径NADPH氧化酶系统的激活在氧中毒肺损伤中更为重要。但也有研究发现，高氧诱导的肺内皮细胞ROS的产生始于线粒体途径的激活，随后才有细胞内钙离子信号和Rac亚族Rac1转位所激活的NADPH氧化酶的参与。线粒体复合物Ⅰ的抑制剂鱼藤酮(rotenone)和细胞内的钙离子螯合剂能够完全抑制高氧诱导的NADPH 氧化酶的激活[7]。

NADPH氧化酶的激活是一个非常复杂的过程，需要其细胞质成分p47phox、p67phox和Rac1/2转位到膜上，与膜上的Nox(NADPH oxidase，Nox)蛋白家族和p22phox正确装配形成复合物[8]。除了NADPH氧化酶成分的正确装配，肌动蛋白细胞骨架的重排和脂质筏结构也参与NADPH氧化酶的激活。引起NADPH氧化酶激活的信号转导途径也是非常复杂的，至今尚未完全阐明。但通过不同环节抑制NADPH氧化酶的激活都能减轻ROS的产生，减轻高氧所诱导的肺损伤严重程度。由于内皮细胞ROS的产生能够介导内皮屏障的破坏，所以抑制NADPH氧化酶的激活还能减轻高氧所诱导的肺通透性的增加，维持内皮屏障。

研究证实，高氧能够诱导细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和 p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导途径的激活，从而诱导内皮细胞NADPH氧化酶的激活[9]。Src激酶能够促使高氧条件下p47phox的磷酸化，从而激活NADPH氧化酶，Src的显性失活或小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)则能够减少高氧条件下内皮细胞ROS的产生[10]。磷脂酶A2、磷脂酶C和磷脂酶D也都参与内皮细胞NADPH氧化酶的激活[11]。肌动蛋白细胞骨架的重排和其结合蛋白皮层蛋白(cortactin)的磷酸化使细胞质中的p47phox转位，从而诱导内皮细胞NADPH氧化酶的激活和ROS的产生[12]。肌动蛋白稳定剂的预处理能够减少内皮细胞ROS的产生，肌动蛋白解聚剂则使ROS产生的基础量和高氧条件下ROS产生的诱导量明显增多[13]。肌球蛋白三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)酶是促使细胞骨架发生重排的动力因素，肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)或 Rho蛋白激酶调节的肌球蛋白轻链的磷酸化能够诱导NADPH氧化酶的激活和ROS的产生[14]。和MLCK激活的作用类似，内皮细胞膜上的脂质筏也是介导内皮细胞产生ROS的一个支架结构，它通过募集NADPH氧化酶中的各种亚成分和细胞骨架蛋白诱导NADPH氧化酶的激活。IQ模体的RasGTP酶活化蛋白1(IQ motif containing GTPase activating protein 1，IQGAP1)能够与Nox2相互作用调节ROS的产生[15]，小窝蛋白1(caveolin-1，Cav1)表达量的下调或基因缺失也能部分减少内皮细胞中ROS的产生[16]。

除了抑制线粒体途径和NADPH氧化酶的激活，其他抗氧化剂的使用也能通过抑制环加氧酶、一氧化氮合酶、细胞色素P450系统和黄嘌呤氧化酶等ROS产生途径减少高氧诱导的ROS过度产生，如N-硝基-L-精氨酸-甲基酯(N-Nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)、二联苯碘(diphenyleneiodonium，DPI)和夹竹桃麻素(apocynin)等[17]。

3 炎症细胞浸润和肺内炎症反应的调控

除了ROS过度产生，大量炎症细胞募集入肺所引起的肺内炎症反应也是氧中毒肺损伤的一个重要特征，而且炎症细胞浸润与肺损伤的严重程度密切相关[18]。

炎症细胞浸润与其趋化能力有关。高氧使促炎症因子和趋化因子的趋化作用大大增加，所以高氧使炎症细胞的趋化能力大大提高。研究证明，白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)是氧中毒肺损伤中的一个重要的介导者[19]。IL-8需要CXC趋化因子受体-1(CXC chemokine receptor-1，CXCR-1)和 CXCR-2相互作用产生它的趋化作用[20]。高氧能够诱导CXCR-2 的表达量上调[21]。通过基因缺失[22]或使用CXCR-2配体中和抗体的方法[23]，抑制IL-8的趋化作用能够明显减少肺组织中的白细胞数量，减少肺泡上皮细胞的凋亡和改善肺损伤小鼠的生存率。

高迁移率族B1蛋白(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是另一个可以作为干预靶点的促炎症因子。HMGB1是在全身性炎症反应中发现的一个强有力的促炎症因子，它可以作为信号分子诱导其他多种促炎症因子的释放，扩大局部和全身的炎症反应[24]。高氧能诱导肺损伤小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中HMGB1的累积和巨噬细胞中HMGB1的表达，重组HMGB1能诱导巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、巨噬细胞炎症蛋白-2(macrophage-derived inflammatory mediator-2，MIP-2)的释放[25]。

白细胞从血管内进入肺泡腔需跨越内皮细胞和上皮细胞屏障，黏附分子对于白细胞与内皮细胞或上皮细胞间的相互作用非常重要。CD11b/CD18、CD44、胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1、ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)和跨膜连接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)在高氧和其他诱因导致的急性肺损伤(acutelunginjury，ALI)中都不同程度地在不同时段介导了白细胞在内皮细胞和上皮细胞中的黏附和迁移[26]，但单一阻断某一黏附分子的表达对于减轻氧中毒肺损伤的炎症反应并不十分理想。

炎症细胞募集入肺的过程中还释放大量的蛋白酶和可溶性物质。临床证据显示，ALI患者的BALF和血浆里都能检测到中性粒细胞的弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)，而且其量的多少与肺损伤的严重程度密切相关[27]。动物实验证实，气管内给予弹性蛋白酶能够诱导ALI[28]，抑制弹性蛋白酶则对高氧诱导的肺损伤动物具有保护作用[29]。高氧吸入后，募集入肺的白细胞大量表达MMP9和MMP12，MMP9基因缺失明显增加肺损伤小鼠的生存率[30]。中性粒细胞释放的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、组胺和凝血酶，则通过激活不同的信号转导通路诱导内皮细胞通透性的增加[31]。

高氧诱导的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解也参与肺内的炎症反应。ECM中大分子的透明质酸(haluronic acid，HA)一旦降解为小分子片断即成为信号分子介导炎症反应和诱导肺细胞的凋亡[32]。抑制HA的降解或是给予大分子HA干预能够减轻炎症反应，减少肺泡上皮细胞的凋亡[33]。由于损伤局部的小分子HA片断的清除依赖于细胞表面CD44的存在和其下游Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)所介导的信号通路，所以CD44和TLR4对于HA介导的炎症反应具有调节作用[34]。CD44基因缺失加重高氧诱导的肺损伤[35]。TLR3/4基因缺失使BALF中的白细胞和促炎症因子明显增多，降低高氧诱导的肺损伤动物的生存率[36]。

4 信号转导通路和转录因子活性的调节

肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞连接于同一基底膜上，构成肺泡上皮屏障，维持正常的肺功能。ROS和炎症反应能够直接引起肺泡上皮细胞的损伤。除了凋亡和坏死，高氧还能诱导肺泡上皮细胞的另外一种死亡方式，即所谓的肿瘤病(oncosis)[37]。但无论是凋亡还是非凋亡性的肺泡上皮细胞的死亡都会引起一系列调节细胞凋亡的信号转导通路的激活。利用抑制剂或是基因敲除的方法，MAPK家族成员包括ERK1/2、Jun氨酸末端激酶(Jun amino-terminal kinase，JNK)1/2和p38MAPK被证明在高氧诱导的肺泡上皮细胞损伤中发挥着调节细胞凋亡和炎症反应的重要作用。

ERK途径的激活能够减轻高氧诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡，其选择性抑制剂PD-98059的应用则取消了这种保护作用[38]。线粒体乙醛脱氢酶(mitochondrial aldehyde dehydrogenase，mtALDH)和具有抗炎性质的肌苷也是通过ERK途径的激活或者是代偿性Akt途径的激活减轻高氧诱导的肺泡上皮细胞的凋亡[39]。但也有实验证实，ERK1/2的激活增加了小鼠肺泡上皮细胞-12(murine lung epithelial cell-12，MLE-12)对于高氧诱导的细胞凋亡的敏感性，PD-98059的处理则明显减少了高氧小鼠肺组织中Caspase-3的激活和原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL)阳性细胞数[3]。类似的结果也曾出现于高氧诱导的巨噬细胞损伤中[40]。所以，在高氧诱导的肺损伤中，ERK1/2促进或抑制凋亡的作用可能是依赖于细胞类型和培养条件的。与ERK1/2不同，JNK和p38MAPK则能够促进高氧诱导的多种肺泡上皮细胞株的凋亡，因而在高氧诱导的肺泡上皮细胞损伤中被认为是凋亡或非凋亡性细胞死亡的促进因素[41]。

尽管激活MAPKs信号通路的上游基因目前不是很清楚，但多种基因和转录因子已被证明在高氧诱导的肺损伤中被MAPKs途径激活并作为其下游的效应分子，其中包括促进细胞凋亡的 Bax/Bid、Caspases、p53和抑制细胞凋亡的B细胞淋巴瘤因子-2(B cell lymphoma-2，BCL-2)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1)、热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)、Akt、抗氧化反应元件(antioxident response element，ARE)、TLR4 以及 IL-6、IL-11、IL-8、IL-11β、TNF-α、VEGF、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor，KGF)等多种细胞因子和促炎症因子[42]。

高氧还能诱导多种核转录因子的激活，被认为发挥重要介导作用的有核因子-κB(nuclear factorkappa B，NF-κB)、激活蛋白-1(activating protein-1，AP-1)、核因子 E2调节因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)及信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)。

高氧诱导的NF-κB的激活及其作用具有细胞种类特异性和损伤特异性。高氧能够诱导非小细胞肺癌耐药细胞株A549细胞NF-κB的激活，但对于细胞凋亡并没有保护作用[43]。NF-κB的激活增强高氧诱导的肺损伤小鼠中肺细胞的凋亡，其活性抑制则抵消这种对于凋亡的促进作用[44]。与此相反，抑制高氧诱导的NF-κB的激活增加了肺上皮细胞的非凋亡性死亡，并且减少了具有细胞保护作用的锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)的表达[45]。高氧预处理的非小细胞肺癌耐药细胞株A549细胞由于NF-κB的激活减少了过氧化氢(hydrogenperoxide，H2O2)诱导的细胞凋亡，抑制NF-κB的激活则保护作用消失[46]。实验证实，高氧诱导的NF-κB的激活及其作用还受发育的影响。高氧能够诱导新生鼠而不是成年鼠肺组织中NF-κB的激活，与成年鼠相比，新生鼠对于高氧具有较强的耐受力，抑制新生鼠肺组织中NF-κB的激活则其肺损伤程度与成年鼠相比差别无统计学意义[44]。然而临床证据显示，NF-κB活性增强与早产儿呼吸窘迫综合征有关，能够增加支气管肺泡发育不良的风险[47]。

和NF-κB类似，高氧诱导的 AP-1激活也受到发育的影响，并具有组织特异性[48]。阻断AP-1的激活能够增加高氧诱导的大鼠肺泡上皮细胞的凋亡[41，49]。在高氧诱导的非小细胞肺癌耐药细胞株A549细胞损伤中，JNK/AP-1途径激活的一个特异性的下游靶基因就是IL-8启动子，AP-1的激活通过IL-8诱导肺内的炎症反应[50]。

NRF2在正常情况下被阻遏蛋白Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，KEAP1)固定于细胞质，在外源物或氧化剂的作用于与KEAP1解离，转位入核，通过ARE诱导一系列具有解毒作用的酶类的表达，如谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferases，GSTs)和NADPH氧化酶、笨醌氧化还原酶等[51]。高氧能够诱导肺的NRF2基因激活[52]。NRF2基因缺失小鼠的肺损伤加重，不能上调ARE介导的抗氧化酶的表达，与野生型小鼠相比，存在一系列基因表达上的紊乱[53]。

STAT基因缺失明显加重高氧诱导的肺损伤，使包括IL-6在内的促炎症因子的表达明显增加[54]。STAT基因组成性的过表达则能通过抑制中性粒细胞释放的MMP9和MMP12在氧中毒肺损伤中发挥保护作用[30]。

ROS的过度产生和大量炎症细胞募集入肺是高氧诱导肺损伤的主要原因。ROS和肺内炎症反应诱导众多复杂而相互叠加的信号转导通路的激活和下游靶基因及转录因子的表达变化，导致肺泡上皮细胞的损伤和肺内通透性的增加。高氧诱导的肺损伤是一个非常复杂的综合征，至今尚未有确切而有效的治疗方法。减少ROS的过度产生，减少炎症细胞的募集入肺，调节MAPKs、NF-κB等信号转导通路和转录因子的活性是氧中毒肺损伤中的重要干预靶点，但尚需要更加深入的研究。在复杂的病理生理机制和相互叠加的信号转导通路中寻找共同点是进一步研究的一个方向，以达到单一阻断但获取多方面保护作用的潜在效应。

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