哺乳动物细胞核移植研究进展

王爱萍

（四川卫生康复职业学院 基础教研室，四川 自贡 643000）

哺乳动物细胞核移植是指将发育不同时期胚胎细胞或成年动物体细胞的细胞核，经显微操作，移植到成熟的去核卵母细胞中，组成重构胚并使之发育成新动物个体的技术。细胞核移植是动物克隆的主要途径，所以又称之为克隆技术。1997年体细胞克隆绵羊Dolly的诞生（Wilmut et al,1997）,是细胞核移植技术的一个重要的里程碑。它向全世界证明了高度分化的体细胞具有遗传的全能性和发育的可逆性。在科学领域引发了克隆动物研究的高潮。

1 核移植技术的国内外研究现状

细胞核移植技术是德国发育生物学家Spermann[1]于1938年为解决核质相互关系问题提出把分化的细胞导入去核的卵母细胞中并观察其胚胎发育情况的研究，同年他还提出将任何时期的细胞核注入去核卵母细胞内然后通过观察其发育能力就可以确定该时期细胞核的发育潜能的设想。但由于当时核移植技术条件的限制，用分化的细胞未能获得成功。直到20世纪50年代，才有两栖类美洲豹蛙和非洲瓜蟾克隆的报道（Briggs和King,1952）。随后Gurdon等用蟾蜍、蝌蚪的肠上皮细胞和体外短期培养的完全分化的体细胞进行核移植分别获得成体蟾蜍和蝌蚪，证实两栖类已分化细胞的基因组具有结构上的完整性和功能上的全能性。此后，人们转向哺乳动物细胞核移植研究。

哺乳动物核移植研究的最初成果在1981年取得，Illmensee和Hoppe[2]用鼠内细胞团细胞直接注入去核的合子后，培育出发育正常的3只小鼠。但这一试验未能被重复出来；1983年，McGrath和Solth首次利用显微操作技术和细胞融合技术，以单细胞期的小鼠胚胎作为供核细胞进行核移植，得到了核移植后代，并建立了重复性很高的核移植操作程序[3]；1994年，Collas和Barrnes将供核细胞通过卵母细胞内直接注射的方法构建了核移植重构胚胎，并得到了犊牛[4]；这一时期许多研究者对胚胎干细胞和成年动物体细胞的核移植试验也做了大胆尝试，但进展不大。1997年，在细胞核移植研究历史上发生了一件具有轰动效应的事件，英国罗斯林研究所的研究人员首次利用成年母绵羊的乳房上皮细胞，通过细胞核移植技术得到了体细胞克隆羊——“Dolly”[5]，“Dolly”的出生以事实向人们证明，完全分化的体细胞不仅可以被逆转，而且完全可以发育成一个新的个体。从此以后，全世界掀起了体细胞克隆的热潮。1998年Wakayama等利用小鼠卵丘细胞进行体细胞核移植研究获得成功[6]；1999年Wells等用牛颗粒细胞进行核移植也获得了成功[7]。至2002年，Keefer等[9]人将91枚重构胚移植到8只受体山羊体内，50%受孕，生出7只小山羊，核移植效率明显比以前提高。迄今为止，全世界已有乳腺细胞[5]、卵丘细胞和输卵管上皮细胞[8]、颗粒细胞[7]、肌肉细胞[10]、皮肤细胞[11]、睾丸支持细胞[12]、胎儿成纤维细胞[9]和耳皮肤成纤维细胞[13]等9种体细胞克隆后代成功诞生。

我国的细胞核移植技术研究开始于20世纪60年代。1963年，著名试验胚胎学家童第周利用胚胎细胞克隆技术进行鱼类囊胚细胞核移植研究，在70年代获得属间和种间核移植鱼。上个世纪九十年代起，国内学者开始进行哺乳动物克隆研究。1991年，张涌等[14]利用4～32细胞的胚胎克隆了5只山羊。2000年，杨向中领导的科研小组，用一头17岁高龄奶牛耳皮肤细胞进行体细胞核移植研究，获得了6头体细胞克隆牛[15]。标志着中国已完全掌握了世界一流的体细胞克隆牛技术，从1997年到现在短短几年的时间里，在体细胞核移植领域里，人们相继在牛、山羊、猪、猫和兔等多种动物上取得了成功。

2 目前核移植技术中存在的问题

2.1 体细胞克隆成功率低

同体外授精相比，效率低是目前核移植技术应用发展中普遍存在的现象。主要表现在:囊胚发育率不稳定，移植后受胎率低，出现畸胎、死胎、流产以及出生后早亡率高，造成效率低。但不同的学者对此产生的意见却不一，有人认为是培养条件未达到最佳化，也有人认为是细胞的问题，现有资料表明，即使应用体内培养的方法成活率也不过10%,看来试图通过改进培养体系来提高核移植效率还无从着手。因此，要更深入地研究核质间的互作机理，以便使核移植技术得到进一步改善。

2.2 供体核与受体胞质细胞周期同步的问题

第一次体细胞核移植获得成功的重要因素之一就是对细胞周期同步化的认识，而且研究人员也首次认识到应用G0期细胞的必要性。目前体细胞核移植中常用的方法就是将处理后的供体细胞核移入到去核的MII期卵母细胞中，迄今为止，几例成功的猪体细胞核移植研究中，都采用了去核的成熟MII期卵母细胞作为核受体。大多数研究者认为用成熟的去核MII期卵母细胞作为核受体，有利于启动已分化的供体核在重构胚中的再程序化，保证一定的核移植成功率。当用去核的MII期卵母细胞作为受体细胞时，必须使供体细胞与受体细胞的细胞周期同步化，这样有助于重组胚胎的发育。 在卵母细胞激活后，MPF活性下降、染色质去凝集，在核膜重建的过程中 DNA复制，染色体加倍，因而核移植时供体细胞周期的选择对于第一次细胞分裂末期，染色体二倍体的保持是很重要的。

2.3 体细胞基因突变和其他遗传问题

研究证明，基因突变与DNA复制次数有着密切的关系，分裂次数越多的体细胞，发生突变的可能性越大。对于核移植材料来源方面，这是不可避免的问题。如果把动物的基因组弄清楚，并能对体细胞的突变基因加以修复的话，核移植的效率一定能够得到大大的提高。

3 哺乳动物核移植技术的应用前景

3.1 扩大优良育种群和拯救濒危动物

采用核移植技术可加速育种的过程，在短时间内有效地扩大种群的数量，保持种群的性状，避免了自然交配所带来的优良性状的分离和减弱。将核移植与基因打靶相结合，可以对物种的基因进行定点修饰，产生具有优良性状的新品种。用家畜的体细胞进行基因打靶可将我们感兴趣的目的基因插入到特定的位置，把筛选出的阳性克隆作为核供体进行核移植，这样便可获得组织特异性表达的转基因动物。

3.2 体细胞克隆技术在医药生产方面的价值

将体细胞克隆技术与生物反应器的生产制作技术结合可以对体细胞进行转基因或基因组修饰后，制作生产生物反应器 利用动物的乳腺、膀胱等器官，生产治疗人类疾病、保健所需的蛋白。许多全球知名的生物技术企业尤其看重体细胞克隆技术在这些方面的应用价值，纷纷投资科研机构开展研究，实际上第一个体细胞克隆动物绵羊Dolly的诞生就是这种动机的直接产物。

3.3 在临床方面的作用

通过深入研究细胞核质的相互作用 控制胚胎细胞的分化方向，有望获得适合向人体移植的具有遗传改变的动物器官。通过细胞核移植技术可以避免不必要的免疫排斥作用。目前，人们已经利用体细胞克隆技术获得了小鼠-小鼠、人-兔、人-人 ES细胞系，并已经在小鼠模式上开展了如帕金森氏症等神经退行性疾病的治疗尝试。

4 结语

尽管目前来看，哺乳动物核移植仍然面临很多问题，哺乳动物核移植技术自身仍在不断完善中但相信随着分子遗传学、细胞生物学和发育生物学等相关基础学科的进一步发展，哺乳动物核移植将在未来的生物学及人体器官移植等方面扮演着重要的角色。

［1］Spemann H.Embryonic development induction[M].New York:Hafner Publishing Co.,1938:210－211.

［2］Illmensee K,Hoppe PC.Nucler transplantation in Mus musculus developmental of nuclei from preimplantation embryos[J].Cell.，1981,23（1）:9－18.

［3］McGrath J,et al.Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery cell fusion[J].Science，1983,220:1300－1302.

［4］Collas P,et al.Nuclear Transplantation by microinjection of inner cell mass and granulose cell nuclei[J].Mol Reprod Dev，1994,38:264－267.

［5］Wilmut I,Schnieke AE,McWhir J,et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature，1997,385:810－813.

［6］Wakayama T,Perry ACF,Zuccotti M,Johnson KR,Yanagimachi R.Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.Nature，1998,394:369－374.

［7］Wells DN,Misica PM,Tervit HR.production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulose cells[J].Biol Reprod.1999,60:996－1005.

［8］Kato Y,Tani T,Sotomaru Y,Kurokawa K,Kato J,Doguchi H,Tsunoda Y.Eight calves cloned from somatic cells of a singer adult[J].Science，1998,282:2095－2098.

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［11］Kato Y,Tani T,Tsunoda Y.Cloning calves from various somatic cell types of male and female adult newborn and fetal cows[J].Repord Fertil，2000,120(2):231－237.

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［14］张涌，王建辰，钱菊汾，等.山羊卵核移植的研究[J].中国农业科学，1991，24（5）:1－6.

［15］桑润滋，主编.动物繁殖生物技术[M].北京:中国农业出版社，2002.