饲料中牛羊源性成分的定性检测——定性聚合酶链式反应法（PCR）法[1]

王小林 薛 静

（河南省医药学校，河南 开封 475000）

疯牛病（BSE）是发生在成年牛的一种慢性进行性高致死性神经系统疾病，属人兽共患病。自1985年在英国发现以来，现已波及30多个国家和地区。由疯牛病引发的公共卫生问题、社会经济和政治问题已超过疯牛病本身。疯牛病以其病原超强的抵抗力、传播方式的特殊性、超长的潜伏期和高致死性正在成为有史以来对人类威胁最大的传染病之一。疯牛病主要通过食物链传播，是由于牛食用了含有朊病毒的肉骨粉饲料所致，禁止含牛羊源性成分饲料的生产,流通,使用,成为预防疯牛病感染,流行的主要手段之一。对饲料中牛羊源性成分的检测具有重要的意义[2]。本方法的最低检出限为0.25%。

1 仪器，试剂与样品

1.1 仪器

1.1.1 高压灭菌锅

1.1.2 离心机(micromax型,美国Thermo公司)

1.1.3 迷你旋涡混合器(minishaker)

1.1.4 水浴锅

1.1.5 PCR仪(T-Gradient Thermoblock,德国Biometra公司)

1.1.6 电泳仪(PowerPace universal,Biorad公司)

1.1.7 凝胶电泳成像系统(GelDoc XR型,Biorad公司)

1.2 试剂[3]

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。

1.2.1 动物源性植

1.2.2 物饲料基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)

1.2.3 电泳缓冲液:称取 54 g Tris,27.5 g硼酸,20 mL EDTA溶液,然后用水定容到 1 L,使用时10倍

1.2.4 稀释 Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane，

1.2.5 三(羟甲基)氨基甲烷,EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid，

1.2.6 乙二胺四乙酸。

1.2.7 10mg/mL溴化乙锭溶液

1.2.8 琼脂糖 电泳纯。

1.2.9 25 umol/L引物溶液

1.2.10 Taq DNA 聚合酶(5U/μL)Taq:Thermus aquaticu，

1.2.11 水生栖热菌

1.2.12 各10mmol/L的四种脱氧核糖核甘酸混合液 (dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

1.2.13 DNA分子量标

1.2.14 记物 100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp （大连宝生物）

1.3 样品

从各地抽检的16种饲料做牛羊源性成分检测，同时作阳性对照，阴性对照，空白对照。

阴性对照:不含牛或羊成分的饲料中提取的DNA作为PCR反应的DNA模板；

阳性对照:含牛或羊成分的饲料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；

空白对照:用无菌重蒸馏水作为PCR反应体系的模板。

2 方法

2.1 饲料中牛羊DNA的提取

取50mg研磨粉碎的动物源性饲料于离心管，依所用试剂盒中的操作提取DNA。如下:向管中加320μL缓冲液GA，振荡；加20μL(20mgml-1)蛋白酶，混匀，65℃水浴 30min；加 340μL 缓冲液 GB，混匀，水浴10min；12000rmp离心2min，取上清液400μL于新管，向上清中加200μL无水乙醇混匀，将其全部加入一个吸附柱CB3中 （有收集管），离心2min倒掉废液，放回收集管中；加500μL去蛋白液GD离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回。再用漂洗液PW700μL，500μL分别洗吸附蛀，离心30秒，倒掉废液，放回收集管；空离心2min后，室温放数分钟，将吸附柱转入一新的离心管，加200μL洗脱液TE，放5min，离心 2min。 TE:Tris-Cl、EDTA 缓冲液。

2.2 PCR 反应

向 200μLPCR 反应管中依次加入 10×PCR 缓冲液 5μL，1μL 各10mmolL-1的四种脱氧核糖核甘酸混合液，引物溶液（含正向和反向引物）各 1μL，摸板 DNA10μL Taq DNA 聚合酶 1μL，加入灭菌水,使反应体系达50μL。以4000r/min离心10s后，PCR扩增，95℃恒温1～3min；30次扩增反应循环（95℃恒温30～60s，56℃恒温 30～60s，72℃恒温 30～60s）；然后72℃恒温5min，取出PCR反应管。

2.3 PCR产物的电泳检测

取 3g琼脂糖加入200mL电泳缓冲液，加热溶解，稍冷加12μL的EB混匀，倒胶，冷凝。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL～8μL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样。9V／cm恒压，电泳30min，结束后将凝胶置于凝胶成像仪上成像，拍照。

3 结果

对所抽取的16个样品做牛羊源性成分的检测结果如下。每个样品均做平行样，前四个分别为M，阳性对照，阴性对照，空白对照。

在饲料中牛源性成分的检测中，饲料编号为S2007C0254，S2007C0372，S2007C0374的三个中检出结果为阳性。

在饲料中羊源性成分的检测中，饲料编号为S2007C0254，S2007C0372的两个中检出结果为阳性。

4 讨论

4.1 所取饲料要粉碎，颗粒大小在0.125mm以下；在DNA提取中，振荡至彻底悬浮，且温浴期间离心管底出现沉淀时也要将其振荡至彻底悬浮；在样品的水浴过程中，其间要混匀样品2-3次；上清液与无水乙醇的体积比为1:2；空离心后放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验；洗脱液TE的体积不少于50μL，体积过小影响回收效率。

4.2 PCR反应仪有边缘效应，应把PCR反应管放中间位置，且PCR反应管要盖紧，否则会污染PCR仪。

4.3 在电泳的配胶加入溴化乙锭溶液时，要带一次性手套。EB有致癌作用。

在整个操作过程中要注意防止交叉污染，严格操作。

［1］饲料中牛羊源性成分的定性检测.GB/T 20190-2006定性聚合酶链式反应（PCR）法[S].

［2］疯牛病的医药途径性潜伏危害及建立相关检测方法的迫切性[J].中国药事，2002，16（4）.

［3］SN/T 1119-2002进出口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法 PCR方法[S].中国标准出版社.