大肠杆菌信号转导系统研究进展

原荣荣，夏 远

（内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特010021）

1 引言

大肠杆菌作为一种模式生物被广泛用于细菌信号转导机制的研究。尽管目前还有许多信号蛋白的生理功能还不清楚，但是由于其在信号转导方面与其它一些原核生物或真核生物存在着许多相似性，目前仍被作为一种重要的研究模式菌。尤其是在大肠杆菌三种菌株全序列公布之后，为全面认识大肠杆菌基因组中各种与信号转导机制相关的编码信息创造了条件，从而在基因序列层面上，打开了对未知信号转导蛋白生物功能与转导机理研究的序幕。大肠杆菌作为一种研究广泛的生物模式菌，其信号转导机制要比一些相关的专性致病菌复杂，例如：嗜血性流感杆菌（Haemophilusinfluenzae）或嗜肺军团菌（Legionellapneumophila）。另一方面，大肠杆菌编码的信号转导蛋白比其非共生条件致病菌少得多，例如铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、沙雷菌（Shewanellaoneidensis）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）。因此大肠杆菌信号转导是一个易于操作的试验系统，能为了解真核生物信号转导机理提供许多参考信息。

2 细菌信号转导途径的多样性

大肠杆菌中所发现的组氨酸激酶（histidine kinases，HK）和甲基接受趋化蛋白（methyl－accepting chemotaxis proteins，MCPs）是两类研究最多的与信号转导相关的膜结合受体蛋白。随着基因测序技术的快速发展以及生物分子学实验技术的不断进步，许多其它类型的信号转导受体蛋白被相继发现，其中包括丝氨酸/苏氨酸（serine/threonine，Ser/Thr）蛋白激酶和蛋白磷酸酶、腺苷酸环化酶、二鸟苷酸环化酶和环化二聚单磷酸鸟苷（Cyclic dimeric guanosine monophosphate，c－di－GMP）特异性磷酸二酯酶［1］。

由组氨酸激酶和MCPs受体参与的信号传递过程常被定义为二组分信号转导途径，该过程涉及组氨酸激酶到响应调节蛋白之间的磷酸基传递的全过程。二组分信号转导途径形式极其多样，一般包含三个基本过程：

（1）激酶分子上组氨酸残基的磷酸化；

（2）磷酸基从组氨酸激酶转移到与其同源的响应调节蛋白分子的天冬氨酸残基上；

（3）响应调节蛋白的构象发生改变，使得其与染色体DNA分子上特定基因或者细菌鞭毛等其他结构的相互作用发生变化，在一些情况下表现为对酶活性的调节。

趋化信号传递是一种特殊的二组分信号转导途径，信号最先由MCPs开始传递，MCPs与组氨酸激酶CheA发生特异性反应，将磷酸基传递给响应调节蛋白CheY。CheY蛋白含有独立受体结构域，但不含磷酸基输出结构域。鞭毛的移动性主要基于磷酸化的CheY蛋白与位于鞭毛底端的FliM蛋白相互作用而实现，这种相互作用影响着鞭毛旋转的方向，从而调节趋化响应［2］。

磷酸转移酶系统（Phosphotransferase System，PTS）参与糖的吸收，该系统包含一系列负责在磷酸转移过程中从磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）向六碳糖（包括：N－乙酰甘露糖胺，葡萄糖，甘露糖，葡萄糖胺和N－乙酰葡萄糖胺等）转移磷酸基的蛋白质。在大肠杆菌中的PTS磷酸转移体系含有两种关键蛋白——PTS酶Ⅰ与葡萄糖特异性酶II。PTS酶I（EI）的磷酸化水平直接影响着细胞的趋化性，而葡萄糖特异性酶II（EIIAGlc）的磷酸化水平调节着细胞中腺苷酸环化酶的活性［3］。

Ser/Thr蛋白激酶主要通过将细胞中靶蛋白上的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化及去磷酸化等一系列级联反应传递信号。Ser/Thr蛋白激酶不仅存在于真核生物中，同时也存在于原核生物体内，但目前为止大肠杆菌体内只有很少一部分蛋白被证实通过这一途径实现信号转导。在某些情况下，Ser/Thr蛋白激酶自身具有去磷酸化活性。研究发现，Ser/Thr蛋白磷酸酶对靶蛋白的去磷酸化反应与Ser/Thr蛋白激酶的磷酸化反应是一对互逆反应［4］。

环化单磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是细胞体内一种关键的第二信使，通过与不同启动子的相互作用，对转录加以调控。环化单磷酸腺苷的细胞水平受到腺苷酸环化酶的调节。这种调节机理包括cAMP受体蛋白（cAMP receptor protein，CRP）与cAMP的特异性结合，随后触发CRP构象发生变化，增加其与DNA的亲和力，从而活化其它一些与其相应的基因或操纵子的转录。

c－di－GMP是另外一种存在于细胞内的第二信使，在生物体内通过二鸟苷酸环化酶信号转导通路来调控其生理功能。c－di－GMP调节与细胞表面成分有关的多种功能，包括：菌体运动，蛋白质和多聚糖的分泌，生物膜的组成和某些致病因子的生成。c－di－GMP的某些生理功能是通过与PilZ结构域的结合来实现调节，其他功能可能包含有另外的结合蛋白，包括二鸟苷酸环化酶本身。c－di－GMP特异性磷酸二脂酶用于催化c－di－GMP水解，同时也能作为c－di－GMP的结合蛋白［5］。

3 大肠杆菌的信号转导机制

3.1 二组分组氨酸激酶

细菌基因组编码的组氨酸激酶种类繁多，这些感受蛋白主要分布于细胞膜，用于响应转导不同类型的刺激信号。大部分组氨酸激酶的差异源于感受蛋白与识别信号分子结构域的不同，它存在于外周胞质，嵌入膜内或者细胞质。典型的组氨酸激酶是一个跨膜受体，常常包含多个感受结构域，例如，位于外周胞质感受结构域以及细胞质中的配体结合PAS（Per－ARNT－Sim，PAS）结构域。两者相比而言，组氨酸激酶在细胞质中的信号转导模体相当地统一，都含有两个结构域，即由长α螺旋和C末端球状ATP酶结构域组成的二聚化/磷酸化组氨酸激酶A（Histidine Kinase A，HisKA）结构域。组氨酸激酶在信号传递过程常以二聚体形式存在。二聚体中一个分子的ATP酶结构域结合ATP并将其γ磷酸基转移到其他二聚体分子HisKA结构域保守区的组氨酸残基上，接着又将磷酸基转移到与其同源的响应调节蛋白的接收结构域天冬氨酸残基上。

大肠杆菌K12编码30种组氨酸激酶，其中有6种功能还不清楚（RstB，YehU，YpdA，YfhK，and YedV），余下的 24 种分别为：BaeS，BasS，CpxA，EvgS，RcsC，and RscD用于响应外膜压力［6］；EnvG 与KdpD用于响应渗透压以及钾离子浓度梯度的调节；PhoQ，PhoR用于感应磷酸盐和钙镁离子；NarQ，NarX用于感应硝酸盐与亚硝酸盐；ArcB，BarA感应氧和过氧化氢；CusS，ZraS用于重金属的感应（例如：Cu＋、Ag＋、Zn2＋和 Pb2＋）；二羧酸盐和三羧酸盐由 CitA 和DcuS感应；六磷酸葡萄糖（UhpB），谷氨酰胺（GlnL），N－氧三甲胺（TorS），乙酰醋酸盐（AtoS），QseC负责群体感应［7］。

人们越来越关注有多少种组氨酸激酶同时感应外膜压力和渗透压，或是细胞氧化还原电位和末端电子受体浓度。事实上，不同组氨酸激酶共存于同一细胞，它们之间按照一定的精度相互作用。例如，NarQ和NarX之间存在着复杂的功能划分。但是，在很多情况下，二者之间功能层次体系还不为人所知［8］。Noriega等研究发现，NarX－NarL和NarQ－NarP对硝酸盐的响应调节是一个不对称交联调节系统，NarQ与响应调节蛋白NarL和NarP具有相似的结合力，而NarX更偏向于与NarL蛋白相互作用［9］。

3.2 二组分响应调节蛋白

二组分响应调节蛋白是一类含有共同磷酸基受体REC结构域（receiver domain）的不同蛋白质的总称，REC结构域常常也称作CheY同源受体结构域。这个结构域催化磷酸基从组氨酸激酶HisKA结构域的组氨酸残基转移到响应调节蛋白的天冬氨酸残基，同时也参与其自身的去磷酸化反应。每种响应调节蛋白的REC结构域都具有以上两种活性，这决定着其磷酸化形式的半衰期长短，在任意给定时间，响应调节因子活化分子的活性构象（磷酸化）所占的比例。绝大多数响应调节蛋白不仅含有REC结构域，而且还具有多种信号输出结构域。但是一些响应调节蛋白，例如趋化响应调节蛋白CheY，只含有一个独立的REC结构域。CheY仅通过蛋白与蛋白之间的相互作用实现信号的传递。磷酸基从CheA转移到CheY分子上，构象发生改变，使得其与位于鞭毛底端的目标分子Flim的亲和力增强。虽然未被磷酸化的CheY也能与FliM相互作用，但亲和力较弱。所以CheY的磷酸化只是让这两种基本形态之间的平衡发生了偏移，这种平衡的改变直接导致鞭毛旋转状态的改变，从而表现为整个细胞流动性能的变化［10］。

除了CheY蛋白家族成员外，所有其他响应调节蛋白都是双结构域（或三结构域）蛋白，含有REC结构域和信号输出结构域，常位于多肽链C末端。这些蛋白中的大多数通过对特定目的基因转录的活化或者抑制来实施调控。绝大多数输出结构域通常与DNA相结合，但一些响应调节蛋白的输出结构域也能与酶或者配体相互作用。通常与DNA结合的响应调节蛋白属于OmpR/PhoB家族，具有翼状螺旋－转角－螺旋DNA结合域。在大肠杆菌中，OmpR/PhoB家族包含有全部32种响应调节蛋白中的14种。NarL/FixJ家族含有9种响应调节蛋白，这些蛋白具有典型的螺旋－转角－螺旋DNA结合输出结构域。另外一些较为少见的DNA结合响应调节蛋白主要有Fis类型（NtrC家族）和LytTR类型（LytR/AgrA家族）分别含有4种和2种响应调节蛋白。虽然DNA结合响应调节蛋白的结构不同，但在响应外界信号刺激时，都遵循着一种普遍性机制。一般情况下，REC结构域的磷酸化反应有利于其从过渡态转化为具有活性的二聚体形式。响应调节蛋白二聚体的形成是二组分系统进行转录调节的关键步骤。响应调节蛋白二聚体与染色体上串联（或回文）结构的转录调节蛋白结合位点具有较高的亲和力。每种响应调节蛋白对特异性信号的传递过程取决于REC结构域与同源组氨酸激酶以及HTH结构域与DNA目标靶点之间紧密的相互作用。因此，转录调节因子即使具有相似的基因序列（例如：OmpR和PhoB），生物功能也可能明显不同。有些响应调节蛋白含有多个结构域。在NtrC家族转录调节因子中，其N末端具有REC结构域，C末端具有结合DNA特异位点的类似Fis结构域，这两个结构域被AAA型ATP结合域分开，当与DNA分子结合后，表现出ATP酶活性。总之，细菌响应调节蛋白含有种类繁多的输出结构域，处于信号传递链上游，能够合理控制细胞新陈代谢，对环境因素的变化做出适应性响应［11］。

3.3 甲基受体趋化蛋白系统

大肠杆菌K12编码5种甲基接受趋化蛋白（MCPs）。下列分别为5种MCPs以及各自感应的信号分子：Tsr（丝氨酸）、Tar（天冬氨酸，麦芽糖）、Trg（核糖，半乳糖）、Tap（二肽）和Aer（呼吸链的氧化还原态）。其中Aer是细胞用于感应末端电子受体的关键蛋白之一，其决定着呼吸代谢和发酵代谢在细胞体内的主导性。所有这类MCPs都与趋化组氨酸激酶CheA存在着相互作用，并且通过磷酸级联过程将各自信号传递给趋化响应受体蛋白CheY［12］。

3.4 磷酸转移酶系统

磷酸烯醇式丙酮酸依赖的糖磷酸转移酶系统（Phosphoenolpyruvate－dependent sugar：phosphotransferase system，PTS）是一种独立于MCP趋化调节机制的信号转导途径，不仅用于一些特定糖的催化吸收，而且参与磷酸化底物的交联膜运输。在PTS运输糖底物的过程中，同时给趋化系统和腺苷酸环化酶发出偶联信号。PTS蛋白的磷酸化反应与组氨酸激酶类似，都是组氨酸残基被磷酸化。但与ATP－His－Asp或ATP－His－Asp－His－Asp级联过程等典型二组分信号转导过程相比，PTS磷酸级联过程始于磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvic acid，PEP），在随后的参与传递的各组分中（EI，HPr和EIIA）都只含有一个 His残基。PEP水解释放足够的高自由能，确保在缺少糖类底物的情况下，所有PTS各组分处于磷酸化形式。整个磷酸级联过程的限速步骤为EI依赖PEP的自磷酸化反应。当有糖类存在的条件下，PTS组分的磷酸基被快速传递给糖底物，其速率远大于PEP对EI的二次磷酸化过程，导致EI，HPr和EIIA组分部分去磷酸化，此时也会同时向大肠杆菌趋化系统和腺苷酸环化酶发出信号。尽管PTS组分与MCP或CheA之间是否存在直接相互作用还未得到证实，但现有数据显示，未被磷酸化的EI能够与CheA相互作用，从而调节CheA活性与CheY～P的细胞水平。

第二种PTS信号转导机制中包括有EIIAGlc。这种蛋白质能够与腺苷酸环化酶和乳糖通透酶等目标分子相互作用。大肠杆菌细胞编码23种PTS膜组分蛋白，其中有5种（FruA，FrvB，FrwC，HrsA and YpdG）对果糖具有特异性，根据现有试验数据和序列预测，其他PTS膜组分蛋白对以下糖类存在特异性：葡萄糖（PtsG），甘露糖（ManX/Y），甘露糖醇（MtlA，CmtA），N－乙酰氨基葡萄糖（NagE），纤维二糖（AscF，CelB），半乳糖醇（GatC，SgcC），N－乙酰氨基半乳糖（AgaC/D，AgaW），山梨糖醇（SrlA），麦芽糖（MalX），海藻 糖（TreB），α－糖苷（GlvC），β－糖苷（BglF），抗坏血酸盐（SgaB）和 N－乙酰胞壁酸（YfeV）［13］。

因此可以看出，大肠杆菌基因组基因编码的趋化受体几乎包含所有常见的单糖和多种二糖。这些基因的表达水平是否归因于细胞的自身行为，目前仍然是一个悬而未决的问题。目前看来，至少有一些PTS受体基因需要被相应的糖诱导才能得以表达。

3.5 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和蛋白质磷酸酶系统

蛋白质上的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的可逆磷酸化反应是真核生物细胞中一种关键的调节机制。一直以来，Ser/Thr蛋白质激酶被称为“真核细胞”蛋白激酶。但事实上，许多原核生物中也存在有Ser/Thr蛋白质激酶。在一些细菌（放线菌）和古生菌中，Ser/Thr蛋白激酶在信号转导过程中担负着非常重要的作用，且存在着不止一种与之对应的受体蛋白。

包括大肠杆菌在内的很多肠细菌都编码1种或2种Ser/Thr蛋白质激酶和磷酸酶，目前对其特性的了解还较少。起初人们发现UbiB功能类似于2－辛异戊烯基酚羟化酶，在辅酶Q生物合成过程的羟基化反应中扮演关键角色。通过序列分析和实验证实，UbiB被认为是Ser/Thr蛋白质激酶超家族的一员，所有关键活性位点上的残基都具有保守性。但辅酶Q生物合成过程是由UbiB调节，还是由Ser/Thr蛋白质激酶来调控，目前都还不得而知。YegI是另外一种被预测的Ser/Thr蛋白质激酶，有关其功能的研究目前还处于空白［14］。

3.6 腺苷酸环化酶系统

细菌自身编码有多种腺苷酸环化酶，这些酶以ATP为底物合成cAMP。大肠杆菌腺苷酸环化酶是一种可溶性酶，本身并不表现出感应任何外界环境信号的能力。但是，其活性通过葡萄糖特异性磷酸转移酶系统的EIIAGlc组分进行调节。EIIAGlc的磷酸化形式能够活化腺苷酸环化酶，当细胞外葡萄糖浓度较高时，EIIAGlc表现为去磷酸化形式，不与腺苷酸环化酶结合，结合甚至被抑制。因此，当有葡萄糖或其他PTS糖存在的情况下，腺苷酸环化酶的活性会减弱，导致细胞中cAMP的含量降低。这也是产生分解代谢物阻遏现象的机制之一［15］。

3.7 二鸟苷酸环化酶与c－di－GMP磷酸二脂酶系统

许多细菌受体蛋白大多都具有GGDEF和EAL结构域，分别用于合成和水解第二信使c－di－GMP，控制c－di－GMP在细胞体内的平衡。目前研究显示，c－di－GMP与调节生物膜的形成、鞭毛发育和其他多种生理过程有关。

GGDEF结构域约180个氨基酸残基，功能类似于二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclases，DGCs），以两分子GTP为底物生成一分子c－di－GMP。EAL结构域约260个氨基酸残基，功能类似于c－di－GMP特异性磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs），将一分子cdi－GMP水解为线性的pGpG，最终分解为两分子GMP。大肠杆菌编码12种蛋白质具有GGDEF结构域，10种具有EAL结构域，7种同时含有以上两种结构域。由此可以推测同时含有以上两种结构域的蛋白质可能具有催化以上两种反应的活性，在大多数情况下，两种结构域中当一种具有调节催化活性时，另一结构域则失活。但在少数情况下，两种结构域也会同时具有活性［16］。

目前对于大肠杆菌二鸟苷酸环化酶和c－di－GMP特异性磷酸二酯酶相关功能的了解还十分有限。O2（CO、NO）是众多感受配体中的一种，与之对应的YddN蛋白被称为“O2直接感受器”，简称Dos。其他含有GGDEF或EAL结构域的蛋白有：Rtn，YcdT，YddV，YdeH，YeaI，YeaJ，YeaP，YedQ，YegE，YfeA，YfgF，YfiN，YhjK，YliF，YneF，YahA，YcgF，YcgG，YdiV，YhjH，YjcC，YlaB，YliE，YoaD，目前对于这些蛋白感受信号刺激以及相应的调节机理还不为人所认知［17，18］。由基因芯片分析结果发现［19］，YegE，YahA和YaiC蛋白分别受到二组分系统中的UvrT，ArcA和UvrY蛋白正向调控，而YlaB同时受到ArcA和YedW/YedV正向调控。可以推测二组分信号系统可能与c－di－GMP第二信使在信号传递过程中存在着相互联系。

4 大肠杆菌信号转导多种信号复合应答

通过以上介绍可以看出大肠杆菌的信号转导机制是一个复杂的相互联系的网络结构，是细胞应对环境变化，做出应答的基础。环境参数的改变诱导不同的响应通路，表现出不同的响应水平，包括：基因水平（单个基因和操纵子的表达），细胞水平（趋化性，不同信号系统之间的交流），多细胞通讯水平（群体感应，生物膜的形成）。基因表达的调节是多方面的，不仅在转录阶段（改变某一基因、操纵子，甚至全局调节因子的表达），还表现在后转录（mRNA衰减速率调节）和翻译后调节阶段（酶活性的调节，蛋白质稳定性，或蛋白质之间的相互作用）。

在大肠杆菌体内存在的信号转导机制中，大部分的细胞响应既表现于转录调节水平又表现为整个细胞的响应行为，例如：趋化性。大肠杆菌的二组分信号转导系统主要是在转录水平上进行调节，在32种二组分响应调节因子中，有29种能与DNA分子结合。趋化性信号转导途径只包含CheY、CheB两个响应调节蛋白和单一的响应调节蛋白（RssB or Hnr）参与反应后水平的调节。其中RpoS水解反应的等级最终影响到RpoS依赖基因的转录。

另一条环境信号调节转录水平的途径是cAMPCRP系统。正如前面所提到的，通过PTS吸收糖类物质能够影响腺苷酸环化酶的活性，因此，不同分解代谢抑制敏感启动子的转录。通过序列分析，Ser/Thr蛋白质激酶YegI的C末端含有螺旋－发夹－螺旋DNA结合域，故也参与转录调节。细胞二鸟苷酸环化酶引导的信号通路也能够对转录加以调节，这就使得转录调节可能具有多种调控途径，但目前还没有试验对这种推论加以证实［20］。

整个细胞行为水平的改变包括：①细胞趋化响应不同糖、多种氨基酸以及细胞氧化还原电位的变化；②胞外多糖和库利菌毛的合成，最终导致生物膜的形成。这两种细胞行为变化可能反映出细胞在“保持”与“趋化”两种生存模式直接的选择，这一过程似乎被c－di－GMP信号转导途径所支配。另外，c－di－GMP信号途径可能与二组分调控系统（TCS）共同发挥作用。大多数GGDEF和EAL结构域并非独自存在，其中部分被归入了TCS［21］。c－di－GMP可能是许多胞外信号在胞内共同的第二信使。许多GGDEF和EAL结构域蛋白镶嵌在细胞膜上或与细胞膜相连，具有信号感应结构域，能够感应胞外信号，并传至胞内［22］。c－di－GMP可能与细菌群体感应（QS）联系密切。QS与cdi－GMP调控着许多相同的细胞功能（生物膜形成、多细胞性和毒性），所以这两个信号传导机制很可能是相互联系的。

相同的细胞响应可以根据环境触发参数加以分类。目前对组氨酸激酶、MCPs和PTS的膜组分感应环境信号的研究，已成为信号转导领域的热点。一方面，大肠杆菌细胞实时监测着外界环境压力和胞外营养物质浓度的变化。对前者而言，主要包括：外膜压力，渗透压，重金属离子，膜穿透酸（乙酸盐或者苯甲酸盐）。后者主要包括：己糖，多种二糖，二羧酸盐或三羧酸盐，除核糖以外的戊糖和除谷氨酸、丝氨酸、天冬氨酸以外的氨基酸。所有这些化合物对于大肠杆菌的新陈代谢都是非常重要的，例如为什么大肠杆菌主要对己糖敏感，而不是戊糖，或对特定氨基酸敏感，而不是谷氨酸或者天冬氨酸。这些特征可能反映出，大肠杆菌和一些其他肠细菌在富含营养的肠环境适应过程操控机制的简化。

5 展望

尽管目前对于细菌信号转导的研究取得了重要的进展，但即使是被研究得很透彻的大肠杆菌K12模式菌，仍然还存在着许多亟待解决的有关信号转导途径的科学疑问。通过对大肠杆菌信号转导网络系统的研究以及与诱导信号对应的细胞内部或者细胞间的响应调控是将来深入研究的主要方向。对信号转导机制的深入了解并将不同调控机制完美地整合于大肠杆菌代谢途径，构建一套完整的信号转导模型可能是不久的将来该领域研究所面临的主要挑战。

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