粘质沙雷氏菌G1利用玉米浆干粉和磷酸氢二铵生产2，3－丁二醇的研究

郝英利，张燎原，孙建安，魏东芝，周文瑜，沈亚领，朱家文

（1．华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室 鲁华生物技术研究所，上海200237；2．华东理工大学化工分离研究所，上海200237）

随着储量有限的传统能源的日益匮乏，新兴的可再生生物能源引起人们越来越多的重视。2，3－丁二醇（2，3－Butanediol，BD）具 有 高 燃 烧 值 （27 200kJ·kg－1）和低冰点，是一种优良的低温环境下的燃料添加剂［1，2］。2，3－丁二醇用途十分广泛：可以制备多种衍生物，脱水可生成甲乙酮，是广泛应用于电子元件清洗、涂料、染料、印刷油墨、炼油等多个领域的工业溶剂［3－5］；脱水转化生成1，3－丁二烯，是合成橡胶的重要前体［6，7］；脱氢转化生成3－羟基－2－丁酮（乙偶姻，AC），是具有多种用途的天然食用香料［8］；和乙酸可催化合成2，3－丁二醇二乙酸酯，广泛应用于奶制品行业中，用于改善风味［9，10］；通过 Diels－Alder反应可转化为苯乙烯［11］；合成聚氨酯泡沫材料，广泛应用于洗涤剂、药品、化妆品等多个领域［12］；是一种优良的白酒风味添加剂，适当添加可大大提高酒类的口感［1］。

由于2，3－丁二醇具有2个手性碳原子、3种同分异构体，生物法制备2，3－丁二醇极具优势，因而得到了广泛的研究，高产2，3－丁二醇的报道［13］也比较多。然而，多数研究利用的是昂贵的实验级有机氮源［14］，价格较高、不利于工业化生产。

作者在此利用基因改造过的粘质沙雷氏菌G1，以玉米浆干粉（CSLP）和磷酸氢二铵［（NH4）2HPO4］为氮源发酵生产2，3－丁二醇，降低了培养基的成本，为工业化生产奠定了基础。

1 实验

1．1 菌种和培养基

出发菌株：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）G1，实验室保藏，保存于－80℃甘油管中。

斜面培养基（g·L－1）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨5，琼脂20，以NaOH调pH 值7．2。

种子培养基（g·L－1）：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，（NH4）2SO46，KH2PO410，NaCl 0．5，MgSO40．5，以 NaOH 调pH 值7．2，115℃灭菌20min。

发酵基础培养基（g·L－1）：蔗糖90，酵母粉30，（NH4）2HPO43，NaAc 4，柠檬酸钠14，MgSO40．5，FeSO40．02，MnSO40．01。

1．2 培养方法

1．2．1 种子培养

在250mL摇瓶中装入30mL种子培养基，接一甘油管种子至种子培养基中，于30℃、200r·min－1下摇床培养12h。

1．2．2 摇瓶发酵培养

按5%（体积比）的接种量转接种子至装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，于30℃、200r·min－1下摇床培养。

1．2．3 分批补料发酵培养

取100mL种子液接种于3．7L比欧发酵罐（KL F2000），起始装液量为2L，转速为300r·min－1，通气量为0．8VVm，初始糖浓度为90g·L－1，当残糖（RG）浓度低于5g·L－1时，用蠕动泵补料补入800g·L－1蔗糖溶液，控制蔗糖浓度5～10g·L－1。

1．3 实验设计

工业氮源的初筛：分别以价格低廉的工业氮源复合氨基酸、黄豆饼粉、可溶性氮源、玉米浆干粉替代酵母粉配制发酵培养基，4种氮源的浓度均为30g·L－1。

培养基的优化：配制不同浓度玉米浆干粉发酵培养基进行单因素实验；应用Minitab软件系统设计Plackett－Burman（PB）实 验 优 化 玉 米 浆 干 粉、（NH4）2HPO4及无机盐的配比；根据PB实验结果确定爬坡步长，设计爬坡实验；根据爬坡实验结果，应用Minitab软件系统，进行中心组合设计和响应面设计，进行2因子5水平的组合实验。

发酵罐验证：采用恒底物浓度策略［14］进行实验。

1．4 分析方法

菌体浓度测定：采用UV22008H 型分光光度计（Unic）在波长600nm处测定OD600。

发酵液中残糖［14，15］测定：将样品离心，取上清液用2mol·L－1H2SO4溶液水解，再用4mol·L－1NaOH溶液中和，用葡萄糖液体试剂盒（上海捷门生物技术公司）测定葡萄糖的浓度，再换算成残糖浓度。

产物［14，15］测定：用 Aglient GC9860型气相色谱仪测定AC和BD的浓度。色谱柱采用毛细管柱DB－5，FID氢火焰检测器，氮气作为载气，流速为1mL·min－1，柱温为50℃保留115min、然后25℃·min－1程序升温到180℃保留10min，进样口温度为215℃，检测器温度为245℃。发酵液离心后用乙酸乙酯萃取，再用气相色谱仪测定浓度，最后根据标准曲线计算产物浓度。

2 结果与讨论

2．1 工业氮源的筛选（图1）

图1 不同工业氮源对产物的影响Fig．1 Effect of different industrial nitrogen sources on product

由图1可知，复合氨基酸作为氮源时，生物量较低；黄豆饼粉和可溶性氮源作为氮源时，产物浓度较低，杂质较多；玉米浆干粉作为氮源时，不仅能够满足菌体的生长，而且利于2，3－丁二醇的积累。因此，后续实验选择玉米浆干粉作为培养基氮源。

2．2 单因素实验（图2）

图2 玉米浆干粉浓度对产物的影响Fig．2 Effect of CSLP concentration on product

由图2可知，玉米浆干粉浓度在20g·L－1左右时已经可以满足菌体生长、产物合成的需要。

2．3 Plackett－Burman实验筛选培养基中显著因素

应用Minitab软件系统设计PB实验筛选发酵培养基显著因素，实验因素与水平见表1，实验设计与结果见表2。

表1 PB实验因素与水平／g·L－1Tab．1The factors and levels of PB experiment／g·L－1

表2 PB实验设计与结果Tab．2 The design and results of PB experiment

PB实验数据经Minitab 15．0软件分析得到拟合方程如下：

式中：Y 为2，3－丁二醇浓度，g·L－1。

PB 实 验 的 R－Sq为 99．03%、R－Sq（adj．）为96．44%，说明模型对产物水平的变化有良好拟合度。其中玉米浆干粉、（NH4）2HPO4的P值分别为0．014与0．007，说明玉米浆干粉与（NH4）2HPO4对2，3－丁二醇浓度的影响最显著。

2．4 爬坡实验

爬坡实验中玉米浆干粉与（NH4）2HPO4的浓度变化按照PB实验结果逐步增加。步长（4．873，6．279）近似为（1，1．25），即玉米浆干粉浓度每增加1个单位（4g·L－1），（NH4）2HPO4增加1．25g·L－1，结果如图3所示。

图3 爬坡实验结果Fig．3 Results of the steepest ascent experiment

由图3可知，随着玉米浆干粉浓度的增大，蔗糖的消耗速率逐渐加快，2，3－丁二醇的浓度不断提高；当玉米浆干粉浓度大于20g·L－1、（NH4）2HPO4浓度大于7g·L－1时，菌体的生长和代谢逐渐受到抑制。这是因为，高浓度的（NH4）2HPO4会产生游离的氨，对细胞有毒性，造成了对生长和代谢的抑制。

2．5 中心组合和响应面实验

玉米浆干粉（X1）和（NH4）2HPO4（X2）的中心点分别取20g·L－1和7g·L－1，其它培养基组分（g·L－1）如下：蔗糖90、NaAc 4、柠檬酸钠14、MgSO40．5、FeSO40．02、MnSO40．01，进行中心组合实验，其设计和结果见表3。

表3 中心组合实验设计与结果Tab．3 The design and results of the central composition experiment

中心组合实验数据分析经 Minitab 15．0软件分析得到拟合方程如下：

Y＝42．7406＋0．9245 X1＋0．2210 X2－1．52 X21－1．0502 X＋0．0313 X1X2

式中：Y 为2，3－丁二醇浓度，g·L－1。

中心组合实验的R－Sq为96．43%、R－Sq（adj．）为93．88%，表明模型可以解释93．88%的发酵水平的变化。根据回归方程，利用Minitab 15．0软件绘制响应面立体图，见图4。

图4 响应面立体图Fig．4 The three－dimensional graph for the response surface

由图4可以看出，两个因素之间交互作用不显著，最佳点落在实验考察的区域内。为了进一步求证最佳点的值，对回归方程求一阶偏导，通过回归方程计算得到最优的培养基组分浓度为：玉米浆干粉20．32g·L－1、（NH4）2HPO47．21g·L－1，2，3－丁二醇浓度预测值为42．74g·L－1。由此确定的优化培养基（g·L－1）为：蔗糖90，玉米浆干粉20．32，（NH4）2HPO47．21，NaAc 4，柠檬酸钠14，MgSO40．5，FeSO40．02，MnSO40．01。

为验证响应的最优值的可信度，共进行了3批验证实验，18h时的2，3－丁二醇浓度分别为43．72g·L－1、42．45g·L－1和43．02g·L－1，平均值为43．06 g·L－1，与预测值42．74g·L－1基本吻合。

2．6 发酵罐验证实验

在3．7L发酵罐中采用上述优化培养基进行验证实验，结果见图5。

图5 粘质沙雷氏菌G1的分批补料发酵结果Fig．5 The fed－batch fermentation result of Serratia marcescens G1

由图5可以看出，AC浓度为8．35g·L－1、2，3－丁二醇浓度为128．28g·L－1，2，3－丁二醇的产率为2．67g·L－1·h－1、转化率为0．48g·g－1蔗糖。表明以玉米浆干粉、（NH4）2HPO4为氮源，能够大大降低2，3－丁二醇工业化生产中培养基原料的成本，提高了工业化的经济可行性。

2．7 讨论

为了提高工业化生产2，3－丁二醇的经济可行性，可以采取多种方法，如传统的筛选高产菌株、基因改造高产菌株［16］、设计优化便宜有效的培养基等。本研究采用的粘质沙雷氏菌G1菌株为基因工程菌，具有副产物浓度低、发酵过程气泡少、无红色素等特点。副产物浓度低，从发酵原理上简化了发酵控制难度；发酵过程气泡少，从实际操作上降低了发酵控制的难度；菌体不产红色素，有利于发酵液的后续处理。上述特点使得该菌株非常适于工业化生产。

在之前的基础研究中［14］，实验采用较为昂贵的实验级有机氮源，不利于工业化生产，本研究从2，3－丁二醇工业化生产的角度出发，筛选了多种工业氮源，最终确定玉米浆干粉和（NH4）2HPO4为氮源。

玉米浆干粉是玉米深加工行业的主要副产品，来源丰富、价格便宜［17］，其中含有47%的粗蛋白，实验表明玉米浆干粉能够满足菌体生产和转化的需要，有利于积累较高的产物浓度。（NH4）2HPO4作为农用肥具有价格低、供应大、含氮量高等特点，可作为有机氮源的有力补充，满足菌体的生长，且磷酸根能够刺激2，3－丁二醇的合成［18］。

优化后的培养基配方除糖外，只有少量的玉米浆干粉和便宜的无机盐，降低了培养基的成本，为2，3－丁二醇的规模化、工业化生产奠定了坚实的基础。

3 结论

筛选玉米浆干粉和（NH4）2HPO4作为粘质沙雷氏菌G1发酵产2，3－丁二醇的氮源，通过PB实验、中心组合和响应面实验确定最优培养基组成（g·L－1）为：蔗糖90，玉米浆干粉20．32，（NH4）2HPO47．21，NaAc 4，柠檬酸钠 14，MgSO40．5，FeSO40．02，MnSO40．01。摇瓶发酵和分批补料发酵结果表明以玉米浆干粉和（NH4）2HPO4作氮源，2，3－丁二醇浓度较高，培养基的成本大幅降低，为工业化生产奠定了基础。

［1］Garg S K，Jain A．Fermentative production of 2，3－butanediol：A review［J］．Bioresource Technology，1995，51（2－3）：103－109．

［2］Yu E K C，Levitin N，Saddler J N．Production of 2，3－butanediol by Klebsiella pneumoniae grown on acid hydrolyzed wood hemicellulose［J］．Biotechnology Letters，1982，4（11）：741－746．

［3］朱青芳．甲乙酮的合成方法及生产消费情况［J］．医药化工，2007，（3）：33－37．

［4］司航．化工产品——有机化工原料［M］．北京：化学工业出版社，1999：35－39．

［5］程能林．溶剂手册［M］．北京：化学工业出版社，1994：123－125．

［6］王迪，王凡强，王建华．发酵法生产2，3－丁二醇［J］．精细与专用化学品，2000，（7）：20－21．

［7］Long S K，Patrick R．The present status of the 2，3－butylene glycol fermentation［J］．Advances in Applied Microbiology，1963，5：135－155．

［8］李卫凡，邓铎杰，徐少华，等．聚氨酯的研究进展［J］．江西化工，2007，（3）：46－48．

［9］Yang C H，Li Y J，Wen T C．Mixture design approach to PEGPPG－PTMG ternary polyol－based waterborne polyurethanes［J］．Industrial ＆ Engineering Chemistry Research，1997，36（5）：1614－1621．

［10］陕西省化工研究院，聚氨酯弹性体手册 ［M］．北京：化学工业出版社，2001：99－101．

［11］Alam S，Capit F，Weigand W A，et al．Kinetics of 2，3－butanediol fermentation by Bacillus amyloliquefaciens：Effect of initial substrate concentration and aeration［J］．Journal of Chemical Technology ＆ Biotechnology，1990，47（1）：71－84．

［12］Petrini P，Ponti S，Fare S，et al．Polyurethane－maleamides for cardiovascular applications：Synthesis and properties［J］．Journal of Materials Science：Materials in Medicine，1999，10（12）：711－714．

［13］Syu M J．Biological production of 2，3－butanediol［J］．Applied Microbiology Biotechnology，2001，55（1）：10－18．

［14］Zhang L Y，Yang Y L，Sun J A，et al．Microbial production of 2，3－butanediol by a mutagenized strain of Serratia marcescens H30［J］．Bioresource Technology，2010，101（6）：1961－1967．

［15］杨云龙，张燎原，孙建安，等．粘质沙雷氏菌利用蔗糖和柠檬酸铵生产2，3－丁二醇的研究［J］．化学与生物工程，2009，26（9）：41－44．

［16］Zhang L Y，Sun J A，Hao Y L，et al．Microbial production of 2，3－butanediol by a surfactant（serrawettin）－deficient mutant of Serratia marcescens H30［J］．Journal of Industrial Mcirobiology and Biotechnology，2010，37（8）：857－862．

［17］Parekh M，Formanek J，Blaschek H P．Pilot－scale production of butanol by Clostridium beijerinckii BA101using a low－cost fermentation medium based on corn steep water［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，1999，51（2）：152－157．

［18］Berbert－Molina M A，Sato S，Silverira M M．Ammonium phosphate as a sole nutritional supplement for the fermentative production of 2，3－butanediol from sugar cane juice［J］．Z Naturforsch，2001，56（9－10）：787－791．