拟南芥AtWNK9基因的定位及表达分析＊

赵小英，谢敏敏，贺热情，段桂芳，王丽群，李秀山，林建中，刘选明，2†

（1.湖南大学 生物学院，植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410082；2.湖南大学 化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南 长沙 410082）

WNK激酶（With no lysine kinase）是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，属于蛋白激酶家族成员之一，因其家族成员在激酶功能域缺乏保守的赖氨酸而得名[1].该激酶家族成员在通常保守的位于激酶区域第二个亚结构域缺乏一个赖氨酸残基，动物WNK激酶中赖氨酸被半胱氨酸所替代，在植物中常被天冬酰氨（N）或丝氨酸（S）替代，但激酶的生物活性没有发生变化，因此表明WNK激酶是一种特殊的蛋白激酶[2].

Nakamichi等在双子叶植物拟南芥中克隆到植物中第一个WNK基因AtWNK1，随后又成功分离到了AtWNK2－98个WNK基因，并发现At－WNK2，AtWNK4，AtWNK6涉及拟南芥昼夜节律的调控过程[3].AtWNK2，AtWNK5，AtWNK8 的T－DNA插入突变导致拟南芥早开花，AtWNK1的T－DNA插入突变表现出了晚花的表型[4].最新研究发现，破坏AtWNK8能提高拟南芥对盐和渗透压力的抗性[5].目前，在单子叶植物水稻中发现7个WNK基因，其中OsWNK1被发现参与各种非生物胁迫如冷、热、盐、干旱胁迫等[6].Wang等在大豆中鉴定了一个根特异性的WNK同源基因，Gm－WNK1，它通过与ABA分解代谢相关的蛋白GmCYP707A1相互作用微调ABA的水平，从而调控大豆晚期侧根的发育[7].随后又发现GmWNK1能增强植物对NaCl和渗透压的抗性[8].目前，有关拟南芥AtWNK9基因的功能尚处于未知状态，因此系统研究AtWNK9基因的功能对全面了解拟南芥WNK激酶的功能具有十分重要的意义.

生物信息学作为研究过程中的一项技术和开发工具在核酸及蛋白质序列分析及功能预测中发挥重要的作用.基因蛋白结构与表达的生物信息学分析结果对后续基因功能研究有重要的指导意义[9].本研究采用生物信息学和生物学实验相结合的手段，对AtWNK9蛋白结构、亚细胞以及基因表达情况进行了分析，这将为进一步研究该基因的功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 植物材料和载体

拟南芥野生型Col－4为哥伦比亚生态型，大肠杆菌DH5α菌株和pA7－YFP载体均为本实验室保存.

1.2 生物信息学分析

运用简单模块构架搜索工具SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）（http：／／smart.embl－heidelberg.de／smart／）和NCBI网站提供的保守结构域检索工具CDART（Conserved Do－main Architecture Retrieval Tool）（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／）对 AtWNK9蛋白进行保 守 结 构 域 分 析[10－11]；利 用 丹 麦 科 技 大 学（DTU）的CBS服务器上的NetPhos2.0Server程序（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）分析磷酸化位点[12]；利用 WoLF PSORT 工具（http：／／wolfsort.seq.cbrc.jp）和 TAIR网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库SUBA（The SubCellular Proteomic Database）（http：／／suba2.plantenergy.uwa.edu.au／）预测蛋白质亚细胞定位[13－14]；通过TAIR网站中提供的 Arabidopsis eFP Browser链接（http：／／bbc.botany.utoronto.ca／efp／）分析At－WNK9基因的表达谱[15].利用植物Plant CARE在线分析工具（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／plantcare／）对AtWNK9基因上游1 000 bp的启动子顺式作用元件进行分析[16].

1.3 35S：：AtWNK9－YFP融合表达载体构建

以拟南芥野生型Col－4为材料，采用RT－PCR方法，首先提取总RNA并逆转录为cDNA，然后以此cDNA 为 模 板 ，利 用 引 物AtWNK9－YFP－F（ACGCGTCGACATGATGAACAATCTC AGCCATCTT），AtWNK9－YFP－R（ GGACTAGTGT CTTCTTCGTCAGAG TCGTTT）（下划线碱基部分分别为SalⅠ和SpeⅠ酶切序列），通过PCR扩增得到AtWNK9目的基因的全长cDNA序列.采用酶切连接的克隆方法，将该片段连接到pA7－YFP载体中，构建绿色荧光蛋白与AtWNK9基因融合表达的载体35S：：AtWNK9－YFP.

1.4 PEG介导的原生质体转化

为确定AtWNK9基因在细胞中表达的具体部位，将上述构建的35S：：AtWNK9－YFP进行原生质体转化.参照文献[17]的方法，将未抽台前的叶片约90片，切成1mm宽的长条（长度不定），置于500 mmol甘露醇溶液中.将细条捞出，置于含有纤维素酶和果胶酶的酶解液中，黑暗23℃，40～50r／min解析3h以制备原生质体.取约10～20μg 35S：：AtWNK9－YFP质粒于1.5mL离心管中，随后依次加入100μL的原生质体和110μL PEG／Ca溶液，轻柔混匀.放置20～30min后，去除PEG，用W5溶液（154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，2mM MES）终止反应，然后置于云孔板内.23℃ 黑暗下培养6～18h后，在荧光倒置显微镜下观察和分析AtWNK9的亚细胞定位.

1.5 胁迫处理

拟南芥野生型Col－4种子经深层（1% 次氯酸钠10min，无菌水洗5次）消毒后，4℃ 春化3～4 d，然后播种在MS培养基上.放置在22～23℃培养箱连续白光培养12d后，用 ABA（100μM）[18]NaCl（300mM）[19]、葡萄糖（2%）[20]、热（37 ℃）[21]、冷（4℃）[22]进行处理，清水处理作为对照，在不同的时间点收取材料，液氮速冻后，于－80℃保存，用于后续的实时定量PCR分析.

1.6 实时定量PCR分析

采用 TRIGene（GenStar）提取总 RNA，按照Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）试剂盒提供的方法，反转录合成cDNA.在定量PCR仪（Mx3 000P）上，按照SYBR Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time）（TakaRa）定量试剂盒的说明进行定量PCR.PCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环.每个实验至少重复3次，持家基因ACTIN2作为分子内标.本研究采用的定量PCR引物见表1.

表1 AtWNK9定量PCR引物Tab.1 AtWNK9quantitative PCR primers

2 结 果

2.1 AtWNK9蛋白结构分析

运用简单模块构架搜索工具SMART和NCBI中的CDART软件对AtWNK9蛋白进行保守结构域分析，发现AtWNK9在第25到第282个氨基酸区域，包含了一个保守的丝氨酸－苏氨酸激酶催化结构域（STYKc）和一个蛋白激酶催化结构域（PKc）（图1（a）），因此，AtWNK9被归类为丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶家族.利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器上的Net－Phos2.0Server程序对AtWNK9蛋白进行磷酸化位点分析.从图中可看出，AtWNK9蛋白氨基酸序列中的17个丝氨酸（S），2个苏氨酸（Thr）和7个酪氨酸（Tyr）蛋白激酶磷酸化位点（图1（b））.这说明AtWNK9具有自身磷酸化的特点.

图1 AtWNK9蛋白保守结构域及磷酸化位点预测分析Fig.1 Analysis of conserved domain and phosphorylation sites of AtWNK9protein

2.2 AtWNK9基因亚细胞定位分析

采用WoLF PSORT工具对AtWNK9的亚细胞定位进行预测，得知AtWNK9定位在胞质中；采用TAIR网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库SUBA进行预测，得知该基因定位在细胞核中.为进一步确定AtWNK9的亚细胞定位，我们采用PEG介导的原生质体转化方法[17]进行了分析研究.

首先，采用PCR扩增，得到AtWNK9的全长cDNA序列，大小为1 400bp左右（图2（a））.用限制性内切酶SaIⅠ和SpeⅠ将该片段和pA7－YFP载体进行双酶切，分别得到大小为4 900左右和1 400 bp左右的酶切片段（图2（b））.回收酶切片段，用T4 DNA连接酶进行连接反应.将反应液转化大肠杆菌DH5α，然后对阳性克隆进行PCR和双酶切（HindⅢ和BamHⅠ）鉴定，PCR产物及酶切片段大小与预期片段大小相一致（图2（c），（d）），表明成功构建了35S：：AtWNK9－YFP重组质粒.随后，以载体35S：：YFP质粒作为对照，将重组质粒35S：：At－WNK9－YFP转化拟南芥原生质体，在荧光倒置显微镜下观察融合基因的表达情况（图3）.绿色荧光蛋白基因YFP在细胞的所有部位都高效表达（图3（b）），融合基因AtWNK9－YFP则仅在细胞核中表达较强（图3（d）），与蛋白亚细胞定位数据库SUBA预测结果相一致，表明AtWNK9编码核蛋白.

图2 35S：：AtWNK9－YFP融合表达载体构建Fig.2 35S：：AtWNK9－YFPfusion expression vector construction

图3 AtWNK9基因在拟南芥原生质体中的表达分析Fig.3 Expression analysis ofAtWNK9 in protoplast ofArabidopsis

2.3 AtWNK9组织器官表达模式分析

基因的时空表达模式可为预测和研究其生物学功能提供参考依据.根据TAIR网站中eFP Browser连接提供的数据，对AtWNK9基因在拟南芥不同组织器官中的表达谱进行了分析整理（图4（a））.AtWNK9基因在拟南芥植株的根、下胚轴、叶、花等各个组织器官中均有不同水平的表达，在根中的表达量最高.此外，AtWNK9在不同部位的叶片、茎、花和花粉中的表达也存在一定的差异但表达水平都比较低（图4（a））.为了进一步确定AtWNK9基因在不同组织器官的表达模式，采用实时荧光定量PCR检测了该基因在拟南芥根、莲座叶、茎生叶、茎、花和果荚中的表达情况.从图4（b）中可看出，AtWNK9在所有被检测的组织器官中均有表达，其中在根中的表达量最高，约为其它器官中的3～5倍，其次为茎.这与eFP Browser连接提供的数据基本一致，推测AtWNK9可能参与根的生长发育.

图4 AtWNK9基因在拟南芥不同组织器官中的表达Fig.4 Expression ofAtWNK9in different organs ofArabidopsis

2.4 AtWNK9基因表达对非生物胁迫的响应

利用植物启动子顺式作用元件分析网站Plant CARE在线分析了AtWNK9基因上游1 000bp的调控区域.结果发现，AtWNK9基因的调控区域存在大量激素响应与胁迫响应相关的元件，包括赤霉素反应元件（Gibberellin－Responsive Element，GARE）、热胁迫响应元件（HSE）、逆境和胁迫响应元件（TC－rich－repeats）等顺式作用元件.

为了研究AtWNK9基因的表达是否响应激素、逆境胁迫，实验中对12龄拟南芥幼苗分别进行ABA、盐、葡萄糖、热、冷胁迫处理，采用实时定量PCR分析了AtWNK9基因的表达情况.结果如图5所示，AtWNK9基因的表达受胁迫处理强烈诱导，其中ABA的诱导效应最明显，AtWNK9的转录水平在ABA处理4h即达到峰值，为对照处理的8～9倍，在随后的8h内其表达量仍然维持较高的水平；AtWNK9基因对NaCl处理的响应更快，在处理2h达到最大值，为对照处理的8～9倍左右，随处理时间延长AtWNK9基因的表达量迅速下降，但仍为对照处理的2～3倍；AtWNK9对葡萄糖、热、冷胁迫的响应相对较弱，分别在葡萄糖处理4h，热、冷处理6h达到最大值，为对照处理的5倍、3倍和6倍；AtWNK9对水处理（对照实验）几乎没有响应，说明AtWNK9基因为植物胁迫反应相关基因.

图5 胁迫处理拟南芥幼苗中AtWNK9基因表达的实时定量PCR分析Fig.5 Real－time quantitative PCR analysis ofAtWNK9gene expression in stress－treatedArabidopsisseedling

3 讨 论

对基因的生物信息学分析，可为预测其生物学功能提供参考.本研究首先利用生物信息学的手段对AtWNK9的核苷酸及蛋白质序列进行了保守结构域和磷酸化位点分析，发现AtWNK9基因包含与蛋白激酶催化结构域（PKc＿）和丝氨酸－苏氨酸催化结构域（STYKc）具有高度相似性的结构域，且存在多个磷酸化位点，与WNK激酶家族中其他成员的结构特征一致[23]，因此，AtWNK9具有自身磷酸化特点，这还需作进一步研究.

基因的表达部位及表达模式通常与基因的功能有紧密的联系.结合生物信息学分析、原生质体转化及荧光定位分析，得知AtWNK9在细胞核中表达，说明AtWNK9基因编码核蛋白.此外，根据eFP Browser提供的数据及实时定量PCR分析，证明了AtWNK9基因在拟南芥根中高效表达，这与Wang等的RT～PCR实验结果相吻合[4]，说明AtWNK9可能参与根的生长发育.

利用Plant CARE对AtWNK9启动子顺式作用元件进行分析，结果显示：启动子区域存在大量激素响应与胁迫响应相关元件.通过激素和胁迫处理发现，AtWNK9基因的表达受ABA，NaCl等非生物胁迫强烈诱导，说明AtWNK9为非生物胁迫反应相关基因.这为进一步研究AtWNK9基因的生物学功能奠定了良好基础.

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