共染MIP－1α与B7－1诱导乳腺癌大鼠免疫应答能力的研究

梁莉萍，贾存东

（新疆医科大学附属肿瘤医院：1.病理科；2.肿瘤内科，乌鲁木齐 830011）

乳腺癌是女性中常见的恶性肿瘤，且发病率随着社会的发展而趋向增长［1－2］。对于乳腺癌的治疗手段多样，大大提高了患者的生存率，但其病死率仍较高，尤其是对于乳腺癌晚期及远处转移的患者，普通的治疗手段往往效果难以令人满意［3－4］。随着医疗相关学科及技术的发展，基因治疗引起了各学者的重视［5］。目前，关于乳腺癌基因治疗的研究仍较少，因此，笔者通过动物实验探讨共转染 MIP－1α与B7－1基因对乳腺癌大鼠免疫效应应答的影响，为临床对乳腺癌患者实施基因治疗提供一个初步的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级环境下饲养的SD雌性大鼠40只，体质量25～30g，7～10d；源性乳腺癌细胞株SHZ－88及经逆转录或（和）培育的SHZ－88亲代细胞、SHZ－88／MIP－1α细胞、SHZ－88／B7－1细胞及SHZ－88／MIP－1α＋B7－1细胞。

1.2 研究方法

1.2.1 乳腺癌大鼠造模及成瘤实验 采用SHZ－88乳腺癌细胞建立乳腺癌大鼠模型40只，观察模型的稳定性；将实验动物按照接种细胞的不同分成对照组（接种SHZ－88亲代细胞）、MIP－1α组（接种 SHZ－88／MIP－1α细胞）、B7－1组（接种 SHZ－88／B7－1细胞）及联合组（接种SHZ－88／MIP－1α＋B7－1细胞），每组10只，观察接种后有无肿瘤生长。

1.2.2 转基因细胞对乳腺癌大鼠的治疗方法 各细胞均经丝裂霉素C灭活，浓度为2.5×107／mL，1周注射1次，每次0.2 mL，共治疗2次。治疗完成2周后取一半大鼠的外周血检测CD4＋、CD8＋百分比和CD4＋／CD8＋比值以及白细胞介素2（IL－2）、人γ干扰素（IFN－γ）水平，另一半大鼠用于观察肿瘤体积变化以及生存时间。

1.2.3 观察指标 计算注射转基因肿瘤细胞后乳腺癌大鼠肿瘤体积分别在第1周、第2周、第3周及第4周的大小；记录实验大鼠的生存时间，计算每组的平均值；采用流式细胞术检测大鼠外周血CD4＋、CD8＋百分比和CD4＋／CD8＋比值；使用酶联免疫吸附试验法检测大鼠外周血的IL－2、IFN－γ水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0建立数据库并对数据进行处理分析，计数资料采用的形式表示，组间差异采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SD大鼠造模及成瘤结果 采用SHZ－88细胞建立的乳腺癌大鼠模型均成功且稳定，致瘤率达到100%，且肿瘤体积随着时间的延长不断增大。在肿瘤细胞接种10d后，采用SHZ－88亲代细胞接种，成瘤性达到100%；采用SHZ－88／MIP－1α接种，成瘤性降低到20%；采用SHZ－88／B7－1接种，成瘤性降低到30%；而采用SHZ－88／MIP－1α＋ B7－1接种则成瘤性消失且保持无瘤状100d以上。

2.2 乳腺癌大鼠肿瘤体积的变化 注射转基因肿瘤细胞的荷瘤大鼠的肿瘤体积在1～4周均较对照组小，差异有统计学意义（P＜0.05）；而在第2周、第3周及第4周，联合组荷瘤大鼠的肿瘤体积均明显小于MIP－1α组及B7－1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 乳腺癌大鼠肿瘤体积的变化（cm3，，n＝10）

表1 乳腺癌大鼠肿瘤体积的变化（cm3，，n＝10）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与联合组比较。

组别 1周 2周 3周 4周0.89±0.113.26±0.198.05±0.5453.38±2.49 MIP－1α组 0.85±0.08a1.30±0.11ab 3.53±0.33ab 8.22±0.52ab B7－1组 0.86±0.12a1.39±0.13ab 3.84±0.38ab 9.31±0.44ab联合组 0.82±0.14a1.03±0.10a1.64±0.29a5.48±0.47对照组a

2.3 荷瘤大鼠外周血T淋巴细胞亚型百分比比较 MIP－1α组、B7－1组及联合组外周血T淋巴细胞亚型CD4＋、CD8＋的百分比与CD4＋／CD8＋均较对照组高（P＜0.05）；且联合组明显高于 MIP－1α组及B7－1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 荷瘤大鼠外周血T淋巴细胞亚型百分比的比较（，n＝10）

表2 荷瘤大鼠外周血T淋巴细胞亚型百分比的比较（，n＝10）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与联合组比较。

组别 CD4＋（%） CD8＋（%） CD4＋／36.29±1.03 13.19±0.89 2.19±0.20 MIP－1α组 40.80±1.71ab 15.81±1.29ab 2.79±0.09ab B7－1组 40.79±1.28ab 16.41±1.04ab 2.71±0.14ab联合组 44.28±4.10a 19.81±1.91a 3.08±0.23 CD8＋对照组a

表3 荷瘤大鼠生存天数、外周血IL－2及IFN－γ水平的比较（，n＝10）

表3 荷瘤大鼠生存天数、外周血IL－2及IFN－γ水平的比较（，n＝10）

a：P＜0.05，与对照组比较；b：P＜0.05，与联合组比较。

组别 生存天数（d） IL－2（pg／mL） IFN－γ（pg／mL）53.39±1.15 9.17±1.02 24.27±2.23 MIP－1α组 63.79±1.62ab 11.40±1.20ab 33.09±2.29ab B7－1组 64.19±1.91ab 11.47±1.24ab 33.20±2.22ab联合组 89.01±2.54a16.77±1.33a 58.06±3.35对照组a

2.4 荷瘤大鼠的生存天数、外周血IL－2及IFN－γ水平比较MIP－1α组、B7－1组及联合组荷瘤大鼠的生存天数均明显多于对照组（P＜0.05）；且联合组较 MIP－1α组及B7－1组明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05）。MIP－1α组、B7－1组及联合组大鼠外周血的IL－2及IFN－γ水平均明显高于对照组（P＜0.05）；且联合组的水平明显高于 MIP－1α组及B7－1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

肿瘤患者存在不同程度的免疫抑制［6－7］，且随肿瘤负荷的增大而越趋明显，导致肿瘤局部未能显现出有效的抗肿瘤免疫应答［8］。因此，尝试提高免疫效应细胞的数量及质量，激发机体产生抗肿瘤免疫应答，增强肿瘤局部免疫原性，逆转免疫抑制状态，可达到治疗肿瘤的效果。

MIP－1α主要生物功能有［9－10］：管理炎性反应；参与 T 淋巴细胞免疫反应；增强单核、巨噬细胞、T淋巴细胞与内皮细胞的黏附性；诱导各种炎性介质的产生等。肿瘤细胞往往缺乏B7分子的共刺激作用，未能有效激活T细胞，使得肿瘤细胞未能被机体免疫系统攻击［11］。转染B7－1分子，促进第二信号系统作用，激活T细胞效应，可产生抗肿瘤作用［11－12］。本实验结果显示在乳腺癌大鼠模型内接种转染MIP－1α与B7－1细胞后，成瘤性消失且保持无瘤状态超过100d，荷瘤大鼠生存时间明显长于转染单基因及亲代肿瘤细胞大鼠。可见转染 MIP－1α与B7－1能够提高肿瘤局部有效的免疫效应细胞数量及质量，提高肿瘤的免疫原性，激发强烈的抗肿瘤作用。

T淋巴细胞介导的细胞免疫是抗肿瘤免疫效应机制的最主要部分，其主要元素是激活状态下的T细胞CD4＋及CD8＋2个亚型，加以CD4＋／CD8＋可作为反映机体免疫功能状态的指标［13］。CD4＋细胞参与巨噬细胞、B细胞、NK细胞等的激活，还可分泌各种细胞因子，从而起到抗肿瘤的作用［14］。CD8＋细胞对肿瘤细胞具有一定的杀伤作用且不伤害正常细胞［15］。细胞因子中以IL－2及IFN－γ在抗肿瘤效应中起主要作用［16－17］。因此，本研究通过测定CD4＋、CD8＋、CD4＋／CD8＋及IL－2、IFN－γ水平来评价荷瘤大鼠接种转基因细胞后的抗肿瘤免疫效应。结果显示，共转染MIP－1α与B7－1细胞的荷瘤大鼠外周血CD4＋、CD8＋百分比和CD4＋／CD8＋比值以及IL－2、IFN－γ水平均明显高于对照组及转染单基因的大鼠，可见共转染 MIP－1α与B7－1后，能明显提高机体的免疫效应，大大提高抗肿瘤作用。

本实验表明，协同 MIP－1α与B7－1的不同作用原理及机制，能增强对乳腺癌大鼠的抗肿瘤作用，疗效明显优于单基因治疗，可为日后进一步的实验研究提供初步的参考。

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