重组人C反应蛋白在甲醇酵母中的分泌表达及鉴定＊

李军明，林 衡，张立超，葛高顺，胡学军△

（大连大学：1.医学院；2.生命科学与技术学院，辽宁大连 116622）

C反应蛋白（C－reactive protein，CRP）是目前发现的重要急性时相反应蛋白之一。其作为灵敏的炎症指标、良好的心血管疾病发病诊断及其发病风险预测指标，对于许多疾病的筛查、监测以及疗效评估具有重要价值［1－3］。目前商品化的CRP及其检测试剂多依赖进口，价格昂贵，阻碍了其临床研究与应用［4］。因此，本研究旨在探索利用真核甲醇酵母表达系统分泌表达并制备具有免疫反应性的重组人C－反应蛋白（recombinant human C－reactive protein，rhCRP），为进一步的rhCRP基础研究及CRP检测试剂的自主研制提供重要的实验材料和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶购自大连TaKaRa公司；Zeocin抗生素、HisTrap HP纯化柱、羊抗鼠IgG－HRP抗体均为Invitrogen公司产品；抗 His－Tag－HRP单克隆抗体、小鼠抗人 CRP单克隆抗体、3，3′，5，5′－四甲基联苯胺（TMB）显色液均购自Sigma公司，其它试剂为进口或国产分析纯。

1.1.2 菌株和载体 毕赤酵母X－33、表达载体pPICZαA均为本实验室保存，大肠杆菌（E.coli）JM109购自大连TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pPICZαA／rhCRP的构建 参照GenBank中检索到的编码人CRP的基因序列及表达载体的多克隆位点的特点，设计rhCRP基因并委托GenScript公司进行人工合成后，经XhoⅠ、XbaⅠ双酶切并插入到载体pPICZαA中后转化至E.coli JM109；通过含Zeocin（25μg／mL）的LS－LB平板筛选阳性克隆，接种并提取重组质粒pPICZαA／rhCRP，然后进行双酶切鉴定及测序鉴定。

1.2.2 重组质粒的酵母转化及筛选 将SacⅠ线性化的pPICZαA／rhCRP及空载体pPICZαA各10μg，分别加入到80μL新制备的酵母感受态细胞中，通过电转化的方式，将它们分别转化入酵母 X－33中，于含Zeocin（100μg／mL）的 YPDS平板上、30℃温箱中培养2～3d并将长出的单个菌落于含Zeocin（100μg／mL）的新鲜YPDS平板上再次筛选。

1.2.3 重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 将筛出的7个单克隆及阴性对照分别接种到含10mL BMGY培养基的50mL离心管中开始表达，方法参照Invitrogen公司提供的酵母表达手册；经浓度为0.5%的甲醇诱导表达120h后，收集样品并取上清进行 Western blotting鉴定分析。然后，进行摇瓶发酵。表达120h并收集全部上清后经0.02mol／L磷酸盐缓冲液透析，用HisTrap HP柱纯化rhCRP。采用SDS－PAGE、Western blotting及Gel DocTM EZ凝胶成像系统检测分析表达纯化产物。

1.2.4 重组蛋白的免疫反应性及稳定性鉴定 纯化蛋白通过间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其免疫反应性。将纯化的rhCRP稀释到适当浓度后，各取100μL稀释液包被酶标板，同时做空白对照；采用1∶6000稀释的鼠抗人CRP单克隆抗体作一抗，1∶5000稀释的羊抗鼠IgG－HRP抗体作二抗；用TMB显色后测定其吸光度值。将纯化的rhCRP样品保存于4℃冰箱4、8周后，分别重复上述的间接ELISA检测。每次检测各重复3次，取平均值进行比较分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料用表示，组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 重组质粒pPICZαA／rhCRP的构建 重组质粒pPICZαA／rhCRP经XhoⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定，可见约为681 bp的目的条带和3491bp的载体条带，片段大小与预期一致，见图1；其测序结果经Vector NTI、Sequencher软件分析显示与设计的基因序列完全一致，表明重组表达载体构建正确。见图1。

图1 重组质粒pPICZαA／rhCRP的酶切鉴定

2.2 重组蛋白的诱导表达 筛选的7个单克隆酵母菌株，经0.5%的甲醇诱导表达120h后，取培养液上清进行Western blotting分析，结果显示，其中3个单克隆在相对分子质质量约23×103处出现明显特异性条带，且大小与预期结果一致，而空载体酵母株未显现出目的条带，见图2。

2.3 重组蛋白的分离纯化及鉴定 纯化的蛋白经SDS－PAGE检测分析显示，在相对分子质量为23×103处成功分离出单一的蛋白条带，相对分子质量符合预期大小且蛋白的洗脱峰集中在2～7管的300mmol／L咪唑洗脱液中，见图3；纯化蛋白经Western blotting检测证实为目的蛋白，见图4；经Gel DocTM EZ凝胶成像系统检测分析表明，一步纯化即获得纯度达90.42%的rhCRP。

图2 目的蛋白rhCRP的诱导表达

图3 纯化重组蛋白的SDS－PAGE分析

图4 纯化重组蛋白的Western blotting分析

图5 重组蛋白的免疫反应性及稳定性鉴定分析

2.4 重组蛋白的免疫反应性及稳定性鉴定 经间接ELISA法将新制备的及于4℃保存4、8周后的rhCRP样品进行其免疫反应性和稳定性的鉴定。结果显示，其吸光度A450平均值分别为0.9621、0.9588和0.9589，差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。

3 讨 论

传统获得人CRP的方法主要是从患者血清或腹水中直接分离纯化得到。由于人血清或腹水成分复杂，故纯化时难度大、操作复杂，而且材料来源困难，产量低［4－5］。随着生命科学的不断发展，通过基因重组技术生产医用蛋白是当今生物及医学研究的热点。目前，国内外利用基因工程的方法获得重组人CRP的研究已有报道［6－9］，但都存在一定的弊端，本实验在前人研究的基础之上，进一步探究更经济、更高效的制备rhCRP的途径。

本研究选用了近年来发展非常迅速的一个真核表达系统－甲醇酵母表达系统，其表达外源蛋白具有众多优势［10］。酵母为简单的单细胞真核生物，既具有原核细胞的生长快，可进行细胞高密度培养的特点，又具有类似真核细胞的翻译后加工修饰功能［11］；既避免了大肠杆菌细胞［8］表达rhCRP时易形成包涵体、纯化复杂等问题，又比哺乳动物细胞［7］和昆虫细胞［6］生产rhCRP的成本低；而且该系统可分泌表达目的蛋白，易于目的蛋白的分离纯化［10－11］。

本研究利用真核甲醇酵母表达系统，成功构建了rhCRP的毕赤甲醇酵母表达菌株，在强启动子AOX1的调控下，成功分泌表达了rhCRP；经一步分离纯化即分离出纯度较高的rh－CRP，并经间接ELISA检测证实其具有良好的免疫反应性和稳定性，为下一步rhCRP的优化表达研究、抗人CRP抗体制备以及人CRP检测试剂的自主研发，提供了重要的实验基础。

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