猪繁殖与呼吸综合征病毒双重荧光RT-PCR 检测方法的建立

张靖飞，张 园，李志辉，王慧煜，曹达江，梅 琳＊

（1.西安市动物疫病预防控制中心，陕西西安710061；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030800；3.中国检验检疫科学研究院，北京100029；4.天杰仁和生物科技（北京）有限公司，北京100029）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome PRRS）又称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以成年猪繁殖障碍、早产、流产和死胎，以及仔猪呼吸异常为特征的传染病，是一种免疫抑制性疫病，常常继发其他病原感染。1987年在北美首次发现该病［1］，目前世界上许多国家和地区都发生过猪繁殖与呼吸综合征，该病于20世纪90年代中期传入我国。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性高致死性传染病，我国于2006年发现［2］。仔猪发病率可达100%、病死率可达50%以上，母猪流产率可达30%以上，育肥猪也可发病死亡是其特征。

猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病毒，国外的研究表明，同一基因型的PRRSV分离毒株之间存在明显的序列差异，特别是在基因组ORF1a的NSP1b和NSP2，ORF3和ORF5的变异性很大［3］。我国已发现NSP2的变异主要表现在氨基酸的缺失，而目前发现的高致病性猪蓝耳病就是由NSP2缺失30个氨基酸的变异株引起的［4-10］。本文根据GenBank上已经公布的国内部分高致病性PRRSV NSP2区的特点设计引物探针，结合PRRSV通用引物探针，建立一种双重荧光RT-PCR的方法，进行PRRSV普通株（以下简称PRRSV）和高致病性株（以下简称HP-PRRSV）的检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞毒 包括高致病性毒株（编号为BJ-4，L11304）和普通株（编号为DX，GZ），毒株均由天津大学黄金海教授惠赠。

1.1.2 病猪样本 共计32份样本。其中24份由天津大学提供，于2010年5月采集自天津蓟县，8份由西安市动物疫病预防控制中心提供，采集自陕西，具体采集时间、地点不详。

1.1.3 其他材料 RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit，QIAGEN公司产品；荧光PCR试剂盒One-step qPCR Kit RNA-directTMReal-time PCR Master Mix，TOYOBO公司产品；IQ5实时荧光定量PCR仪，BIO-RAD公司产品；引物和探针由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据HM853673.1；HM232831.1；HM231830.1；FJ495082.2；HM002808.1；GU169411.1；GQ499194.1l利用引物设探针计软件Beacon Desig-ner 7.9进行高致病性株引物探针设计，PRRSVNSP2-F： 5′-ACGTGTCCCCAAGCTGATG-3′，PRRSV-NSP2-R： 5′-GCAGACAAATCCAGAGGCTCAT-3′，以 及 PRRSV-NSP2-Probe：5′-FAMTTCCTGCACCGCGTAGAACTGTGACA-TAMRA-3′。 通 用 PRRSV-F：5′-TGATGGGCTGGCATTCTT-3′，PRRSV-R：5′-ACACGGTCGCCCTAATTG-3′ PRRSV-P：5′-FAM-TGTGGTGAATGGCACTGATTGACA-TAMRA-3′

1.2.2 病毒RNA提取 利用病毒核酸试剂盒进行RNA提取，最后用40μL Elution buffer洗脱病毒RNA，存入-70℃冰箱备用。

1.2.3 实时荧光RT-PCR 利用2份高致病性株和2份普通株进行荧光RT-PCR，通过不断的摸索和条件的调整，最后确定为如下体系和PCR程序：在200μL离心管中加入2×Master Mix 12.5μL，Mn（OAc）21.25μL，引物（10μmol／L）各0.75μL，探针（10μmol／L）各0.5μL，H2O 4.25μL，RNA 1 μL，总体积25μL。设置荧光通道分别为FAM，HEX。PCR程序为：90℃30s，61℃ 20min，95℃30s，逆转录，然后95℃15s，52℃45s，40个循环，其中54℃45s进行荧光信号收集。

1.2.4 特异性试验 用PRRSV普通株2株，PRRSV高致病性株2株以及其他动物病毒，包括猪瘟病毒，猪流感病毒，口蹄疫病毒以及ddH2O做荧光RT-PCR。在200μL离心管中加入2×Master Mix 12.5μL Mn（OAc）21.25μL引物（10μmol／L）各0.75μL，探针（10μmol／L）各0.5μL，H2O 4.25 μL，RNA 2μL，总体积25μL。设置荧光通道分别为FAM，HEX，PCR 程序为：90℃ 30s，61℃ 20 min，95℃30s逆转录，然后95℃15s，52℃45s，40个循环，其中54℃45s进行荧光信号收集。

1.2.5 灵敏度试验 将产物进行回收、连接、转化、单克隆培养、质粒提取，制备阳性对照。测定质粒浓度，将质粒进行稀释，调整拷贝数为1～107进行荧光PCR，检测最低检测量，反应体系为2×Master Mix 12.5μL，Mn（OAc）21.25μL，引 物 （10 μmol／L）各0.75μL，探针（10μmol／L）各0.5μL，H2O 7.75μL，质粒1μL，总体积25μL。PCR程序为：95℃2min，95℃15s，52℃45s，40个循环，其中54℃45s进行荧光信号收集。

1.2.6 临床样本检测 将收集到的32份样本用本研究建立的方法进行检测。阳性结果测序，做进一步确认。

2 结果

2.1 荧光PCR试验结果

用2份高致病性和2份普通样本核酸进行荧光PCR，结果显示FAM荧光通道4份样本全部为阳性，HEX通道只有两份，即高致病性株为阳性（图1），从而证明该方法可以检测出并且区分出猪蓝耳病高致病性株和普通株。

图1 实时荧光定量PCR曲线Fig.1 Real-time PCR curve

2.2 特异性试验结果

从结果中可以看出，HEX通道检测到4份阳性，HEX通道检测到2份阳性，其余全部为阴性（图2）。

图2 特异性试验结果Fig.2 Specificity of real-time RT-PCR

结果中可以得出该方法可以特异的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且可以区分高致病株和普通株。

2.3 灵敏度试验结果

将质粒稀释成1～107拷贝，进行扩增，得到的标准曲线如图3，扩增效率均＞99%，R2＞0.99。从结果中可以看出FAM通道可以检测出的最低拷贝数为10，HEX通道结合荧光峰图和标准曲线，认为可以准确检测到的拷贝数为102。可以得出反应体系和反应条件可以满足相关基因的扩增效率，可满足样品的检测需要。

图3 普通PRRSV和高致病性PRRSV标准曲线Fig.3 PRRSV and HP-PRRSV curves

2.4 样本检测结果

总共32份样本中，根据灵敏度试验结果，我们确定取Ct≤35为阳性。经过检测，32份样标本中猪繁殖与呼吸综合征高致病性株为19份，普通株为9份，阴性为4份。将所有阳性样本进行测序验证，确定检测结果完全正确（图4）。

图4 部分标本检测结果Fig.4 The test results of part samples

3 讨论

这繁殖与呼吸综合征目前是阻碍我国养猪业发展的一种重要病毒性疾病，尤其是2006年高致病性PRRSV发现之后，对其检测和预防工作也在一步步加强，就我国发现的高致病性PRRSV而言，在基因水平上NSP2基因缺失了30个氨基酸。所以，对于PRRSV普通株和高致病性株的区分必须从这个基因缺失的区段进行，根据这一区段进行引物探针的设计，从而将两者区分。

本研究中，通过对32份临床样本检测，通用阳性率为87.5%，高致病性株阳性率为59.38%。经过测序证明了检测的准确性。由于所采用的临床标本来自两个不同的地区，所以可以确定本方法可以特异的检测出PRRSV以及区分普通株和高致病性株。在灵敏度试验中，该方法检测出质粒的最低浓度在PRRSV可以达到102拷贝，HP-PRRSV可以达到10拷贝，证明了方法有较高的灵敏度，可以满足临床检测的需求。

对于PRRSV的检测目前应用最多的是基于抗原抗体反应的ELASE［11-12］，其次使用最多的是RTPCR［13-14］以及实时荧光定量PCR［15］，但是这些方法都有其局限性，ELASE其优势在于可以快速检测，但是目前还不能区分高致病性株和普通株，而且灵敏度较低。RT-PCR法可以对高致病性株和普通株进行区分，灵敏度介于ELASE和荧光PCR之间，所以可能因为病毒载量的问题而出现假阴性，造成漏检。实时荧光定量PCR的缺点就在于其只能单一检测出高致病株或者是所有的病毒株，不能一次性区分开。而本研究所建立的方法，灵敏度高，特异性强，同时可以完全区分开高致病性株和普通株，从而缩短了鉴别检测时间，具有较高应用价值。

［1］ Wensvoort G，Terpstra C，Pol J M A，et al.Mystery swine disease in The Netherlands：The isolation of Lelystad virus［J］.Vet Q，1991，13（3）：121-129.

［2］ Tong G Z，Zhou Y J，Hao X F，et al.Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，China［J］.Emerg Infect Dis，2007，13（9）：1434-1436.

［3］ Rosendal T，Dewey C，Young B，et al.Distribution of genotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Ontario during 2004-2007and the association between genotype and clinical signs of disease［J］.Canad J Vet Res，2010，74：118-123.

［4］ 杨丽琴，庞海洋，石凤海，等.云南高致病性PRRSV Nsp2和ORF5基因变异分析［J］.动物医学进展，2010，31（11）：15-22.

［5］ 迟 兰，崔 盟，王寿利，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒江苏分离株ORF5及Nsp2基因部分序列分析［J］.中国兽医学报，2010，30（2）：145-149.

［6］ 谢丽基，谢芝勋，刘加波，等.广西高致病性PRRSV Nsp2基因的克隆、序列分析和抗原表位预测［J］.动物医学进展，2008，29（1）：1-4.

［7］ 孙跃辉，黄金海，郭立力，等.PRRSV天津分离株Nsp2基因的克隆和遗传进化分析［J］.动物医学进展，2010，31（4）：26-29.

［8］ 王传锋，马 伟，张 伟，等.PRRSV新疆N基因的克隆及原核表达［J］.新疆农业大学学报，2009，32（6）：51-54.

［9］ 王金凤，张岭岭，王 娇，等.高致病性PRRSV河北地方株的分离鉴定及部分Nsp2基因变异分析［J］.动物医学进展，2010，31（S）：90-93.

［10］ 高 君，冉智光，谭世君，等.2006～2008年重庆部分区县PRRSV分离株ORF5和Nsp2基因的遗传变异分析［J］.中国兽医科学，2009，39（07）：580-586.

［11］ 冉旭华，赵喜红，闻晓波，等，检测PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2008，30（7）：544-547.

［12］ Cai J P，Wang Y D，Herman T，et al.Detection of asymptomatic antigenemia in pigs Infected by porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）by a novel capture immunoassay with monoclonal antibodies against the nucleocapsid protein of PRRSV［J］.Clin Vac Immunol，2009，16（12）：1822-1828.

［13］ 赵泽坤，王 娇，王金凤，等.PRRSV高致病性毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立［J］.广东畜牧兽医科技，2010，35（2）：36-38.

［14］ 肖跃强，管 宇，唐 娜，等.PRRSV经典与高致病性毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2010，30（7）：873-876.

［15］ Tian H，Wu J Y，Shang Y J，et al.The development of a rapid SYBR one step real-time RT-PCR for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Virol J，2010，90（7）：1-7.