肠出血性大肠杆菌O157∶H7的快速可视化检测

吕 恒，张锦海，顾海涛，王 平，王长军，王玉邦

(本文编辑:张仲书; 英文编辑:王建东)

肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)主要包括 O157∶H7、O26∶H11、O111和O104等几种血清型，其中O157∶H7是典型菌株［1］。该病原菌可引起人腹泻、出血性肠炎、血栓性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒症。EHEC O157∶H7的感染具有暴发流行、强致病性、高致死率以及抗生素治疗可能加剧病情等特点［2］。因此快速、特异的检测对于该病的早期诊断及疫情的有效控制至关重要。目前我国EHEC的检测方法有显性培养基分离法、免疫磁珠富集、血清凝集等方法。但这些方法存在费时费力、检测时限长等弊端［3］。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是 Notomi等［4］建立的一种核酸等温扩增技术，能在等温条件下高效、快速、灵敏、特异地扩增靶基因。该方法具有灵敏度高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势，可广泛用于病毒病、细菌病、寄生虫病的诊断［5-7］。本研究以 EHEC O157∶H7的编码脂多糖rfbE基因为靶序列设计引物，建立了优化的LAMP检测技术，并在此基础上应用金属离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue，HNB)判定反应结果，使LAMP的结果判断更简单直观，可为基层医疗机构、疫情现场调查提供快速可视化的检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 Loopamp DNA扩增试剂盒、Loopamp LA-320C实时浊度仪(北京蓝谱公司)，羟基萘酚蓝(HNB)(Sigma公司)，细菌基因组DNA抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒、DNA 250bp marker等(大连宝生物公司)，Eppendorf 5415R离心机(德国Eppendorf公司)，BIO-RAD电泳仪(美国Bio-Rod公司)，紫外分光光度计(美国 Thermo Fisher公司)。

1.2 菌株 EHEC O157∶H7，肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、宋内志贺菌菌株均由军事医学科学院馈赠；福氏志贺菌由解放军86医院馈赠。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank公布的EHEC O157∶H7的 rfbE基因序列(GenBank：S83460)的保守区，采用引物设计软件Primer Explorer 4.0设计LAMP引物及两条环引物LF、LB，由南京金斯瑞公司合成。引物序列见表1。

表1 LAMP引物序列

1.4 DNA模板的制备 按照试剂盒说明书，使用TaKaRa通用基因组DNA提取试剂盒分别提取EHEC O157∶H7、ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋内志贺菌、福氏志贺菌的基因组DNA。

1.5 LAMP反应体系优化

1.5.1 HNB指示剂浓度的优化 将HNB加入LAMP反应体系中，HNB在反应前显紫罗兰色，发生LAMP反应即变为天蓝色。根据现有文献报道的HNB 用量有 120 μmol/L［8］、150 μmol/L［9］，本研究选择了120、150和 200 μmol/L 3个浓度进行HNB显色对比。

1.5.2 配制LAMP反应体系与温度优化 LAMP反应体系总计 25μl，包括：2 × 反应缓冲液 12.5μl，引物混合液 2.5μl(FIP、BIP 各 40 pmol/L，LF、LB各20 pmol/L，F3、B3 各5 pmol/L)，Bst DNA 聚合酶1.0μl，DNA 模板 2μl，HNB 1.0μl(反应浓度 150 μmol/L)，ddH2O 6μl。配制同样的 6 个反应体系，利用LAMP浊度仪分别于61～65℃温育60 min，最后80℃灭活2 min。以最早出现波峰，扩增效率最高为标准选择最佳反应温度。观看颜色反应与LAMP浊度仪判读结果是否一致，产物于25 g/L琼脂糖凝胶电泳分析验证。

1.6 LAMP快速法与LAMP标准法比较 通过三组试验，观察LAMP浊度仪实时扩增曲线、比较体系内加环引物(快速法)与不加环引物(标准法)对实验结果的影响。

1.7 LAMP方法特异性检测 将提取的EHEC O157∶H7、ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋内志贺菌、福氏志贺菌基因组DNA作为模板，进行LAMP扩增，检验LAMP方法的特异性。反应结束后肉眼观察反应管内颜色变化，并与LAMP浊度仪结果及凝胶电泳结果对比验证。

1.8 LAMP方法灵敏度检测 将针对EHEC O157∶H7的rfbE基因的PCR扩增产物(1094 bp)连接至PMD-18载体上(2692 bp)，连接产物的转化感受态细胞，筛选并提取重组质粒，送金斯瑞公司测序。用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，计算质粒拷贝数。计算公式：拷贝数=质粒浓度(g/μl)×加样体积×阿氏常数/(质粒总长度×1个bp的平均分子量)，根据拷贝数将质粒稀释成5×106拷贝/μL，然后进行10倍梯度稀释，检测107至100拷贝/反应管8个浓度梯度。

2 结果

2.1 HNB指示剂不同浓度显色对比 120、150和200 μmol/L 3个HNB浓度进行显色对比，结果见图1。多次验证发现，HNB的浓度为150 μmol/L时，阴性、阳性颜色对比差别最明显，利于可视化判读。

图 1 120 μmol/L(左)、150 μmol/L(中)、200 μmol/L(右)的HNB显色对比

2.2 LAMP反应体系温度优化 对同一反应体系设置不同温度进行反应时，发现在63℃时，LAMP浊度仪最早出现波峰，并且扩增效率最高，因此选择63℃为优化温度进行后续的灵敏度和特异性等实验。

2.3 LAMP快速法与LAMP标准法比较 通过重复3次对比LAMP快速法(加环引物)与LAMP标准法发现，LAMP快速法实时浊度仪显示在15 min开始有扩增产物的出现，在40 min时接近扩增产物峰值；而LAMP标准法在30 min的时候出现扩增产物，在60 min时接近产物峰值(图2)。因此在后续实验中，全部加环引物。

2.4 特异性检测 仅EHEC O157∶H7反应管HNB颜色由紫罗兰色变成天蓝色，LAMP浊度仪检测到阳性扩增结果，而 ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋内志贺菌、福氏志贺菌反应管均未发生颜色变化，LAMP浊度仪也未出现扩增曲线，均为阴性。通过凝胶电泳验证，仅EHEC O157∶H7出现LAMP特有的梯状条带，ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋内志贺菌、福氏志贺菌均未出现。结果与HNB，LAMP浊度仪判读结果一致。见图3、4、5。

图3 LAMP浊度仪特异性检测结果

图 3、4、5 中，1 为 EHEC O157∶H7；2 为 ETEC；3 为EPEC；4为ETEC；5为EAEC；6为宋内志贺菌；7为福氏志贺菌；8为阴性对照。图5中M为250 bp DNA marker。红色：阳性；绿色：阴性；蓝色：累计浊度

图4 HNB特异性检测结果

图5 凝胶电泳特异性检测验证结果

2.5 灵敏度检测 测序证实rfbE基因成功克隆到PMD-18载体上。经紫外分光光度计测定显示质粒浓度为21.52 ng/μl。检测结果显示从107～102拷贝/反应管出现阳性扩增，10个拷贝/反应管以下为阴性。HNB、LAMP浊度仪及凝胶电泳结果一致，见图 6、7、8。

图6 LAMP浊度仪灵敏度检测结果

图6、7、8中，1～8分别为 O157∶H7 质粒模板 107～100拷贝/反应管，图8中M为250 bp DNA marker。本方法的检测灵敏度是100拷贝/反应管。红色：阳性；绿色：阴性；蓝色：累计浊度

图7 HNB指示剂灵敏度检测结果

图8 凝胶电泳灵敏度检测结果

3 讨论

传统的EHEC O157∶H7的实验室检测方法耗时久，检出率低，在食品卫生检测与疫情现场检测领域缺少快速简易的检测方法。核酸检测具有高灵敏度与特异性。LAMP技术原理与普通PCR技术不同，具有诸多优点：一是同时针对目的片段8个不同区域，设计6条LAMP引物及2条环引物，因而具有特异性高的特点。二是由于其反应是等温条件，不需要像普通PCR循环升温降温，因而对设备要求低，普通的恒温水浴锅即可。三是其反应形成哑铃状结构，核酸复制延伸的同时发生链置换反应，剥离先前合成的DNA链，产物是不同长度目的片段的重复序列，扩增效率高，1 h内可将少量目的片段扩增至109［10］。四是在添加环引物情况下，增加了反应的起始点位，提高了反应的速率，在更短的时间内就能出结果。五是其观察结果方式多。

如果通过开盖去检测LAMP反应结果，容易造成气溶胶污染，影响后续检测。在不开盖的前提下，其结果判定方式主要有目视检查浑浊、目视检查染料颜色变化和利用浊度仪对LAMP反应进行实时监控这三种方法［11］。目视检查浑浊法主要依据LAMP反应产生了大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀，但当产物较少时，肉眼很难察觉。实时浊度仪能够更加直观、精确地判定结果，但需要使用特定的仪器设备LAMP浊度仪，其价格昂贵，适合摸索反应条件、科学研究用，并不适合现场快速检测。染料比色分析便捷、直观，是最为简单方便的LAMP结果判定方式，而使用HNB染料指示剂既不开盖灵敏度又高。

本研究采用通过LAMP浊度仪优化检测条件，在反应前加入HNB染料通过颜色变化判断结果，通过凝胶电泳验证HNB颜色变化判读结果的准确性。结果显示，HNB指示剂阴、阳性结果颜色差别明显，易于判断，并且与LAMP浊度仪及凝胶电泳结果判读一致，说明基于HNB染料的LAMP方法结果可信。在加了环引物LF、LB后，增加了DNA扩增的起点，扩增结果较不加环引物提前了20 min，在40 min内即可出结果。本方法检测的灵敏度达到100拷贝/反应管，灵敏度和实时荧光定量PCR相近，比普通PCR高100倍［12-13］。本法特异性强，仅EHEC O157∶H7 阳性，ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋内志贺菌、福氏志贺菌均为阴性。本研究建立了EHEC O157∶H7环介导等温扩增可视化检测方法，整个反应在63℃恒温条件下进行40 min便能直接判定结果，无需特殊仪器设备，简便易行，可用于食品卫生安全抽检及疫情现场快速检测。

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