啤酒花黄酮的纯化工艺及其工艺参数的优化

任治兴，王 玲，潘志勇，孙 新，卢日峰（.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，吉林 长春 300；.吉林省人民医院营养科，吉林 长春 300）

啤酒花（Humulus lupulus）学名为蛇麻、蛇麻花、唐草花等，是桑科葎草属蔓生宿根攀援草本植物［1］。啤酒花作为一种使用历史悠久的药食同源植物，成分复杂，含有十余类化学物质，包括树脂类、挥发油、黄酮类、鞣质、胆碱、粗纤维和氨基酸等多种化学成分［2］。我国的啤酒花资源丰富，总产量处于世界领先地位。啤酒花具有抗结核、安神利尿和健胃消食等功效［3］。目前，啤酒花的用途单一，主要用以啤酒的酿造工业，而在其他方面的用途却未能得到充分的利用。啤酒花有效成分的分离提取对拓展啤酒花的药用价值，特别是啤酒花在医药、食品等领域的应用有着重要的意义。啤酒花中黄酮含量为6%～8%，其中主要有查耳酮、黄酮和黄烷等3类［4］。国内外关于啤酒花黄酮纯化工艺的研究报道较少。本研究以啤酒花为原料对黄酮类物质进行分离纯化，并优化工艺参数，为啤酒花黄酮类化合物的进一步研究和开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 啤酒花、主要试剂和仪器

啤酒花购于新疆保润农业发展有限公司，经鉴定为大麻科葎草属植物啤酒花的雌花序。芦丁标准品购于中国药品生物检定所，生产批号：100080－200707，规格：供实验室药品检验用；D101大孔吸附树脂购于天津市光复精细化工研究所；FL－2和FL－3大孔树脂购于天津欧瑞生物科技有限公司；UV－2550紫外可见分光光度计购于日本岛津公司。

1.2 啤酒花黄酮的浸提

精密称取适量啤酒花按1︰20分别加入30%、40%、50%、60%和70%的乙醇溶液，60℃加热回流2h，趁热抽滤，重复1次，滤液合并，备用。根据浸提效果确定最佳乙醇体积分数。

1.3 啤酒花黄酮的纯化

1.3.1 不同大孔树脂对啤酒花黄酮的吸附及洗脱

取预处理的D101、FL－2和FL－3共3种树脂各5.0g，分别加入pH值为7的啤酒花提取液，25℃、恒温振荡24h，转速为110r·min－1，测定上清液的黄酮含量，计算不同树脂的静态吸附率。将吸附饱和的树脂滤出，用蒸馏水洗涤1次，吸干树脂表面水分，加入70%乙醇溶液40mL，25℃、恒温振荡24h，转速为110r·min－1，测定上清液的黄酮含量，计算黄酮的洗脱率。

1.3.2 FL－3大孔树脂对啤酒花黄酮的吸附 ①吸附液最佳乙醇浓度的确定：分别称取FL－3树脂4份，每份5g，置于具塞锥形瓶中，再分别加入pH＝7、乙醇浓度分别为10%、20%、30%和40%的啤酒花提取液50mL，25℃、恒温振荡24h，转速为110r·min－1，取出上清液测定黄酮含量，计算树脂静态吸附率。吸附率＝（吸附前上清液黄酮浓度—吸附平衡后上清液黄酮浓度）／吸附前上清液黄酮浓度×100%。② 吸附液最佳pH值的确定：分别称取FL－3树脂6份，每份5g，置于具塞锥形瓶中，再分别加入乙醇浓度为20%、pH值为4、5、6、7、8和9的啤酒花提取液50mL，25℃恒温振荡24h，转速为110r·min－1，取出上清液测定黄酮含量，计算树脂静态吸附率，吸附率计算公式同上。

1.3.3 啤酒花黄酮的洗脱 ①洗脱剂最佳乙醇浓度的确定：精密量取啤酒花提取液5份，每份50mL，分别用5g树脂吸附达到饱和，蒸馏水洗涤1次，吸干树脂表面水分。再分别加入40%、50%、60%、70%和80%乙醇溶液40mL，25℃恒温振荡24h，转速为110r·min－1，去上清液测定黄酮含量，计算树脂洗脱率。洗脱率＝洗脱液中黄酮浓度／（吸附前上清液黄酮浓度×吸附率）×100%。②洗脱剂最佳pH值的确定：精密量取啤酒花提取液6份，每份50mL，分别用5g树脂吸附达到饱和，蒸馏水洗涤1次，吸干树脂表面水分。再分别加入pH值为4、5、6、7、8和9的60%乙醇溶液40mL，25℃恒温振荡24h，转速为110r·min－1，取上清液测定黄酮含量，计算树脂洗脱率，洗脱率计算公式同上。

1.4 黄酮含量的测定

1.4.1 标准曲线及回归方程的确定［5］精密称取105℃条件下干燥至恒重的芦丁对照品10.0mg置50mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，摇匀，即得0.2g·L－1芦丁储备液。分别吸取芦丁储备液0、1、2、3、4、5和6mL于25mL容量瓶中，加60%乙醇补充至6mL，加5%亚硝酸钠1mL摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%氢氧化钠溶液10mL，再加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以60%乙醇作空白参比液，在500nm下测吸光度（A）值，以芦丁浓度（C）为横坐标，A为纵坐标建立标准曲线。回归方程：A＝14.5710C＋0.0053（r＝0.9997），线性范围为8～48mg·L－1。

1.4.2 样品的测定 精密称取浸提液3mL置25mL容量瓶中，参照1.4.1中芦丁对照品标准曲线的制备方法绘制样品标准曲线，并依标准曲线计算样品溶液的浓度以及黄酮含量。

1.5 紫外光谱的测定

精密称取样品 ，用甲醇定容至0.04g·L－1的溶液，然后以UV－2550紫外可见分光光度计测定［6］，以甲醇作参比液，扫描波长范围为200～600nm。

2 结 果

2.1 不同浓度乙醇作用下啤酒花黄酮的浸取效果

乙醇浓度在30%～40%范围内，随着乙醇浓度的增加，浸提液中黄酮的含量由1.31g·L－1逐渐增加到1.93g·L－1；乙醇浓度在40%～70%范围内，随着乙醇浓度的增加，浸提液中黄酮的含量由1.93g·L－1减少到1.02g·L－1。见图1。本实验选择体积分数为40%乙醇浸提啤酒花黄酮。

图1 不同浓度乙醇作用下啤酒花黄酮的浸提效果Fig.1 Extraction efficacy of total hops flavonoids after treated with different concentrations of ethanol

2.2 大孔树脂型号的选择

D101、FL－2和FL－3树脂对啤酒花黄酮的静态吸附和洗脱效果：D101大孔树脂的吸附率与洗脱率分别为82.2%和83.6%，FL－2大孔树脂的吸附率与洗脱率分别为45.5%和84.9%，FL－3大孔树脂的吸附率与洗脱率分别为94.2%和97.7%。在相同实验条件下，FL－3树脂的吸附率和洗脱率最高。综合比较3种大孔树脂的吸附率和洗脱率，本实验选择FL－3树脂对啤酒花黄酮进行纯化。

2.3 不同浓度乙醇作用下树脂的吸附率

乙醇浓度在10%～30%范围内，乙醇浓度的变化对吸附率的影响不大。当乙醇浓度大于30%时，随着乙醇浓度的增加，树脂的吸附率由79.2%降到29.4%，下降趋势明显。见图2。本实验选用体积分数为20%乙醇溶液进行吸附。

图2 不同体积分数乙醇作用下树脂的吸附率Fig.2 Absorption efficacy of tota hopsl flavonoids after treated with different concentrations of ethanol

2.4 不同pH值20%乙醇溶液作用下的啤酒花黄酮的吸附率

20%乙醇溶液pH值在4～8范围内，随着pH值的增加，吸附率由88.6%降到62.7%。当pH值大于8时，随着pH值的增加，吸附率略有增加。见图3。本实验采用pH值为4的20%乙醇溶液进行吸附。

图3 不同pH值的20%乙醇溶液作用下啤酒花黄酮的吸附率Fig.3 Absorption efficacy of total flavonoids from hops after treated with 20%ethanol with different pH values

2.5 不同体积分数乙醇作用下啤酒花黄酮的洗脱率

乙醇体积分数在40%～60%范围内，随着乙醇体积分数的增加，洗脱率由60.9%逐渐增加到81.8%。乙醇体积分数大于60%时，随着乙醇体积分数的增加，洗脱率反而由81.8%下降到73.9%。见图4。本实验采用体积分数为60%乙醇溶液为洗脱液。

2.6 不同pH值60%乙醇溶液作用下啤酒花黄酮的洗脱率

在pH值为4～7范围内，随着洗脱液pH值的增加，洗脱率由38.7%逐渐增加到64.9%，当pH值大于7时，洗脱率由64.9%下降到45.4%。见图5。本实验采用pH值为7的60%乙醇溶液作为洗脱液。

图4 不同体积分数乙醇作用下啤酒花黄酮的洗脱率Fig.4 Elution efficacy of total flavonoids from hops after treated with different concentrations of ethanol

图5 不同pH值的60%乙醇溶液作用下啤酒花黄酮的洗脱率Fig.5 Elution efficacy of total flavonoids from hops after treated with 60%ethanol with different pH values

2.7 啤酒花黄酮的紫外光谱特性

紫外光谱扫描结果显示：啤酒花黄酮在375nm处有1个很平缓的肩峰，在277nm处有明显的吸收峰。见图6。

图6 啤酒花黄酮的紫外光谱扫描Fig.6 UV Spectra scan of total flavonoids from hops

3 讨 论

黄酮类化合物（flavonoids）又称黄酮体、黄碱素和类黄酮，是广泛存在于自然界的一大类化合物。黄酮类化合物在植物体内大部分与糖成苷，一部分以苷元存在。不同结构类黄酮的溶解性存在很大差异，苷类极性比苷元强。由于黄酮、黄酮醇和查耳酮等分子间引力较大，难溶于水。根据相似相溶原理，对于极性较大物质的提取，应该选用极性较大的溶剂［7－8，13］，因此本实验用乙醇作为提取剂提取啤酒花总黄酮，并采用大孔树脂静态吸附和洗脱方式对啤酒花总黄酮进行了纯化。

何文静等［5］用超声波法提取啤酒花黄酮时发现：影响啤酒花黄酮的提取因素为乙醇体积分数、料液比和提取时间。从本研究结果可以看出，提取液乙醇体积分数是影响提取效果的主要因素。因此本实验在固定料液比为1∶20，提取时间2h的条件下考察了乙醇体积分数对提取效果的影响，结果表明：最佳乙醇体积分数为40%，该条件下每克啤酒花最高可获77mg黄酮。

在所考察的3种大孔树脂中，FL－3大孔吸附树脂对啤酒花黄酮的吸附率与洗脱率均高于其他大孔树脂，可能其结构有利于啤酒花黄酮的吸附。由于黄酮类化合物中大多数含有酚羟基［3，9，13－14］，本实验结果显示：改变吸附液和洗脱液的pH值对大孔树脂吸附及洗脱效果有明显影响。黄酮类物质的结构决定本身呈弱酸性，因此要达到较好的吸附效果，必须在弱酸性或酸性条件下吸附。洗脱液pH值的升高可促进黄酮类物质的离子化，增加黄酮类物质在洗脱液中的溶解度，同时黄酮类物质的水解也加剧，母核被氧化成醌类化合物［15－16］。本研究结果表明：pH值为4的吸附液吸附效果最好，pH值为7的洗脱液的洗脱吸附效果最好。吸附液和洗脱液的乙醇浓度对吸附率和洗脱率也有一定的影响，这可能与不同体积分数乙醇溶液中黄酮的溶解度变化有关。乙醇体积分数在10%～30%范围内黄酮的溶解度较低，有利于黄酮的吸附，当乙醇体积分数在60%时黄酮的溶解度较高，有利于黄酮的洗脱。

紫外可见吸收光谱法是一种很常用的鉴定化合物的方法［6］。大多数黄酮类化合物甲醇溶液的紫外吸收光谱由2个主要吸收带组成，出现在300～400nm和240～280nm［11］。纯化样品在375nm处有一个很平缓的肩峰，在277nm处有一个很明显的吸收峰，符合黄酮类化合物的紫外吸收光谱特性。

李专等［17］采用聚酰胺树脂柱层析纯化啤酒花CO2萃余物中的黄酮，再用70%乙醇洗脱，得到的样品中黄酮含量为62.2%。本实验采用40%乙醇浸提，FL－3大孔树脂静态吸附的方式，最终得到的样品中黄酮含量为70.6%，收率为70.2%，达到了相同的分离纯化效果。本工艺由于采用了静态吸附的方式，具有操作简便、样品处理量大、树脂易于再生等优点。啤酒花中黄酮类物质的结构特点及其药理作用方面有待进一步的研究。

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