辐照灭菌对川芎中阿魏酸含量的影响

解世全 ，孟 辉 ，王一淞 ，赵焕君，赵 琳

（1.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600；2.沈阳斯佳生物制药有限公司，辽宁 沈阳 110168）

川芎为常用的活血化瘀药,来源于伞形科植物川芎Ligusticumchuanxiong Hort的干燥根茎。临床用于治疗心脑血管、高血压、粥样动脉硬化、抗肿瘤、调节免疫等。

60年代开始，辐照灭菌法应用于食品行业。辐照灭菌大量应用于医药产业，现在应用的辐照灭菌通常利用60Co辐射源放出的γ-射线，γ-射线穿透力强，不仅绝大多数生物体对射线敏感，而且适用于较厚样品，特别是已包装密封物品的灭菌，灭菌效果可靠，并且可有效防止“二次污染”。辐照过程中，被灭菌的物品温度变化小，一般温度只升高2～3℃，适用于含挥发性成分或不耐热药品的灭菌。用辐照灭菌法对中药进行灭菌处理是解决中成药微生物污染问题的有效途径，已受到重视，并被广泛应用。

辐照灭菌法的应用越来越广泛，但是对其在药物灭菌方面的使用情况还有很多问题需要明确，什么药物不能使用辐照灭菌法，可以应用辐照灭菌法灭菌的药物应该选择什么辐照剂量进行灭菌。进而可以加以深入研究辐照灭菌的影响因素，可能引起药物成分发生化学变化的原因，继而寻找避免或减少药物成分被破坏的方法等等。

本课题选择川芎药材饮片及粉末分别进行一定剂量的辐照灭菌，然后对药材中阿魏酸成分进行含量测定，比较灭菌前后阿魏酸的含量变化，考察应用辐照灭菌法进行灭菌，是否会导致川芎中阿魏酸含量变化，为今后的深入研究打下基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器及试剂

agilent 1100型安捷伦高效液相仪（美国安捷伦公司）；CP225D型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DS3120型超声波清洗器（Tianjin Do-Chrom Technology Co.Ltd）；手提式粉碎机（浙江中药机械有限公司）。

无水甲醇（A.R.）（国药集团化学试剂有限公司）；无水甲醇（C.P.）（天津市科密欧化学制剂有限公司）；H3PO4（A.R.）（津市大茂化学制剂厂）

1.2 药材及对照品

川芎药材，购于安徽亳州药材市场，为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的干燥根茎，经辽宁中医药大学许亮副教授鉴定为正品。

阿魏酸对照品（购于中国药品生物制品检定所）。

2 实验内容

2.1 色谱条件

色谱柱：Accurasil-C18（250mm×4.6mm 5um）色谱柱；流动相：甲醇-水-磷酸（30∶70∶0.05）；检测波长：320nm；体积流量：1.0mL·min-1；柱温：30℃；进样量：10μL。

在该色谱条件下,阿魏酸色谱峰达到基线分离。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的阿魏酸适量置于5mL容量瓶内，加甲醇定容，制成6.67μg·mL-1的阿魏酸对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 药品的处理 取川芎饮片若干克，分为3份，将其中一份粉碎约80目，然后将粉末与一份饮片经10K格瑞剂量灭菌制成经辐照灭菌的粉末及饮片，另一份为未灭菌饮片。

2.3.2 供试品的制备 取3份川芎样品粉末，各约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，超声30min，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性范围考察

取阿魏酸样品溶液，依选定的色谱条件进样测定，进样量在4、8、12、16、20μL记录色谱图，读取峰面积，以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归,得回归方程为Y=5012.3X+21.596，r=0.9994。

结果表明，阿魏酸含量在0.02268～0.11340μg范围内，阿魏酸的含量与其峰面积呈良好的线性关系。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察 取未灭菌的川芎药材0.5g，按照上述供试品溶液配制的方法制备成供试品溶液，连续进样6次，记录阿魏酸的峰面积值，计算其RSD值为1.66%，结果表明精密度良好。

2.5.2 稳定性考察 取川芎粉末，按上述供试品溶液配制的方法制备成供试品溶液，密闭、避光于室温放置，分别于0、2、4、6、8、10h进样，测定阿魏酸峰面积值，计算RSD值为1.43%，结果表明供试品溶液在室温避光放置10h内稳定。

2.5.3 重复性试验 取川芎粉末，精密称取6份，每份约0.5g，精密称定，按2.3.2项下方法制备成供试品溶液，进行测定，计算RSD值为1.17%，结果表明重复性良好。

2.5.4 加样回收率 取已知质量分数的同批川芎粉末约0.25g，精密称取6份，置50mL具塞锥形瓶中，加入0.4 mL阿魏酸对照品溶液（6.67μg·mL），再精密加入70%甲醇25mL，按上述供试品溶液配制的方法制备成6份供试品溶液，进样，测定，根据阿魏酸原有量、测得量、加入量计算平均回收率为101.387%，其RSD为1.52%。结果表明，加样回收率良好。

2.6 含量测定

分别各取3种川芎药材粉末，各约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定质量，超声30min，再称定称质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得样品，进样，测定，数据见表1。

表1 含量测定Tab.1 Content determination

2.7 结果分析

采用excel软件进行分析，通过灭菌药材与未灭菌药材阿魏酸含量方差分析可知，F值大于F临界值，P值小于0.05，说明两组数据之间存在着显著性差异。

通过灭菌药材与灭菌粉末中阿魏酸含量方差分析表可知，F值大于F临界值，P值小于0.05，说明两组数据之间有显著性差异。

3 结果与讨论

（1）将阿魏酸对照品溶液在紫外分光光度计上扫描,发现在320nm处有最大吸收且干扰较少,故选择320nm为检测波长。阿魏酸对照品不稳定,受温度、光线等影响易发生转化,含量测定时加入一定量的酸可增加阿魏酸的稳定性。

（2）在提取溶剂的考察上，分别比较了体积分数50%、60%、70%、80%、90%和100%的甲醇及水等,优选出70%的甲醇为溶剂。另外全面考察了不同提取方式、温度、时间、次数等诸多因素。所建立的方法简便可行,易于操作,重现性好。

4 结论

（1）说明通过辐射灭菌法对川芎进行灭菌，其中阿魏酸含量会发生显著性降低。故以阿魏酸为指标说明川芎药材不适宜于采用10K格瑞剂量的辐照灭菌法进行灭菌。

（2）以粉末形式与药材形式进行灭菌，阿魏酸含量亦有明显差异，与辐射灭菌穿透力强的特点不吻合。有待于进一步研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［N］.北京：中国医药科技出版社，2010.253.

［2］刘放，陈冰冰，吴小平.HPLC法测定菊花中绿原酸的含量［J］.西北药学杂志，2010，25（5）：350-352.

［3］卢金清，蒋胜军，卢化，等.高效液相色谱法测定金菊花中绿原酸的含量［J］.时珍国医国药，2006，17（4）:549-550.

［4］周志祥，魏俊德.高效液相色谱法测定菊花中绿原酸含量的方法改进［J］.时珍国医国药，2006，17（11）:2221-2222.

［5］张凤芝，杨翠明，莫日根高娃，等.高效液相色谱法测定明目十六味丸中绿原酸的含量［J］.中国民族医药杂志，2006，12（6）：65-67.