响应面法优化纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜的制备工艺

郑 优，陈厚荣，汪学荣

(西南大学，重庆 400716)

可食膜(edible films)是指以天然可食性物质(如多糖[1]、蛋白质[2]等)为原料，添加增塑剂、交联剂等成膜助剂，通过不同分子间的相互作用而形成的薄膜。蛋清蛋白是一种营养丰富、来源广泛的蛋白质，其含有人体所需的8种必需氨基酸，尤其是含硫氨基酸较多[3]。作为一种重要的食品加工原料，蛋清蛋白具有许多重要的功能特性，如溶解性、持水性、起泡性、成膜性和凝胶性等。近年来，国内外学者已对其部分功能特性作了很多有益的研究[4-7]，但对以蛋清蛋白为成膜主料的可食膜的研究鲜见报道。

近年来，国内外的纳米技术得到了迅速发展，制备纳米粒子的技术日趋成熟，将无机纳米粒子应用于高分子材料[8]、医学[9]、传感器等领域的研究也取得了长足进展。同时，纳米技术的应用也为可食性膜的制备提供了一种新方法。有研究表明，纳米微粒的加入使可食膜的机械性能[10]、阻隔性能[11]及抗菌性能[12]得以改善。

在可食膜的制备过程中，影响膜性能的工艺参数很多，如成膜基质浓度、pH值、加热温度、增塑剂添加量等，这些因素对膜性能的影响也是近年来国内外学者研究的热点[13-15]。本实验以蛋清粉为原料，采用超声波分散技术和流延法制备分散均匀的纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜，并以蛋清蛋白添加量、增塑剂添加量、增强剂添加量和交联剂添加量为考察因素，采用响应面分析法对成膜工艺条件进行优化，探索各因素对膜的拉伸强度、断裂伸长率及水蒸气透过系数的影响，以期为蛋清蛋白在可食膜方面的实际应用提供基础数据和有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛋清粉 成都西亚化工股份有限公司；纳米SiOx粉体(粒径15～20nm) 舟山明日纳米材料技术有限公司；甘油、山梨醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400(均为分析纯)重庆市迎龙化工有限公司；海藻酸钠、环氧氯丙烷、戊二醛和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(均为分析纯) 成都市科龙化工试剂厂；壳聚糖(聚乙酰度为95%) 浙江澳兴生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

手持式测厚仪(0.001mm) 济南兰光机电技术有限公司；PB-10精密pH计 德国赛多利斯公司；DK-8D三孔电热恒温水槽 上海齐欣科学仪器有限公司；90-2型定时恒温磁力搅拌器 上海沪西分析仪器厂；KQ2200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；JJ-1型增力电动搅拌机 金坛市富华仪器有限公司；XYW(L)-PC智能电子拉力测试机 济南兰光机电发展有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜的制备

将0.1g纳米SiOx添加于100mL蒸馏水中，超声分散均匀后，添加一定量的蛋清粉及增塑剂，磁力搅拌均匀，用1mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值，之后加入增强剂、交联剂，在搅拌状态下60℃水浴30min，过滤，超声波脱气，冷却，量取一定量的脱气液于塑料板上流延成膜，将塑料板放入60℃鼓风干燥箱中干燥直至揭膜，之后贮存在装有饱和硝酸镁溶液(RH 50%)的干燥器中均衡48h，待测。

1.3.2 膜性能测定

1.3.2.1 膜厚(FT)

用测厚仪在待测膜上随机取5点测定，结果以“平均值±标准差”表示，膜厚单位为mm。

1.3.2.2 拉伸强度(TS)与断裂伸长率(E)

参照GB/T 13022—1991《塑料薄膜拉伸性能试验方法》的规定，用智能电子拉力测试机测定。采用哑铃Ⅱ形试样测试，试样宽度6mm，标距25mm，试验速度50mm/min，每个试样均作3个平行，结果以“平均值±标准差”表示。拉伸强度(TS)和断裂伸长率(E)分别按下式计算[16]：

式中：TS为拉伸强度/MPa；p为试样断裂时的最大负荷/N；b为试样宽度/mm；d为试样厚度/mm。

式中：E为断裂伸长率/%；L0为试样原始标线距离/mm；L为试样断裂时标线间距离/mm。

1.3.2.3 水蒸气透过系数(water vapor permeability，WVP)参照GB 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸汽性试验方法：杯式法》的规定，采用拟杯子法测定。常温下膜一侧以烘干的无水氯化钙维持水蒸气分压为0kPa，即RH为0，膜另一侧RH为65%(以饱和NaNO2溶液保持)，按下式计算[17]：

式中：W V P 为水蒸气透过系数/(g ·m m/(m2·d·kPa))；ΔW为时间T内水蒸气透过量/g；FT为膜厚/mm；S为膜面积/m2；T为测试时间/d，本实验为2d；ΔPV为膜两侧水蒸气压差/kPa。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验

选取蛋清蛋白添加量、增塑剂添加量、增强剂添加量和交联剂添加量为试验因素，研究这4个因素对膜的拉伸强度、断裂伸长率和水蒸气透过系数的影响效果。试验均作3个平行，结果以“平均值±标准差”表示。

1.4.2 响应面试验

在单因素试验的基础上，以膜的拉伸强度、断裂伸长率和水蒸气透过系数为响应值，利用响应面分析软件，制定四因素三水平的Box-Behnken试验设计，并对各个指标进行工艺参数优化。

1.4.3 数据统计与分析

采用DPS 7.05软件对单因素试验结果进行方差分析(P＜0.05)和多重比较，利用Design-Expert软件对响应面试验结果进行线性回归和方差分析(P＜0.05)，每个试验处理均作3个平行，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 蛋清蛋白添加量的确定

蛋清蛋白添加量直接影响到膜液干燥后能否形成完整膜。蛋清蛋白添加量过低时，膜液过于稀薄，膜液中蛋白质含量较少，分子间相互作用较弱，在涂膜干燥后无法揭膜；蛋清蛋白添加量过高时，膜液较浓稠，水浴加热后可能变成凝胶，导致无法涂膜。故确定合适的蛋清蛋白添加量是十分必要的。

在甘油添加量与蛋清粉添加量的比值为1：4、增强剂CMC-Na添加量0.4g/100mL、交联剂环氧氯丙烷添加量0.4g/100mL的条件下，考察不同蛋白质添加量对膜性能的影响，结果见表1。

表 1 蛋清蛋白添加量对膜性能的影响Table 1 Effect of albumin content on f ilm properties

由表1可知，当蛋清蛋白添加量过低或过高时，不易形成完整膜。通过对结果的方差分析和多重比较可知，膜厚度、拉伸强度和断裂伸长率在8、10g/100mL与12g/100mL两两之间均差异显著，膜水蒸气透过系数在8g/100mL与12g/100mL间有显著差异。随着蛋清蛋白添加量的增大，膜厚度、拉伸强度和水蒸气透过系数均增加，而断裂伸长率下降。膜厚度的增加是膜组成中蛋白质含量增大的结果，拉伸强度的增大是由于蛋白质含量的增大导致分子间相互作用增大，这也导致了膜的柔韧性下降。膜阻湿性能的下降可能是由于膜本身和甘油的吸水性，膜越厚吸水越多。

当蛋清蛋白添加量为10g/100mL时，其水蒸气透过系数与8g/100mL和12g/100mL均无显著差异，并有较好的厚度、拉伸强度和断裂伸长率。综合考虑膜的各性能指标，确定10g/100mL为较适添加量。

2.1.2 增塑剂种类和添加量的确定

图 1 增塑剂对膜拉伸强度的影响Fig.1 Effect of plasticizers on tensile strength of the f ilm

增塑剂是可食膜形成的必要成分，多为小分子的多羟基化合物，它与蛋白质分子间存在键合作用，如氢键，减少了蛋白质分子间或分子内的氢键，增加了内部分子空间，降低了膜的阻隔性，但改善了膜的柔韧性。由于不同种类的增塑剂的分子量和吸水性存在差异，同种增塑剂在不同添加量时的增塑效果也不一样，因此需要确定最适的增塑剂及其添加量。

固定蛋白质添加量10g/100mL、增强剂CMC-Na添加量0.4g/100mL、交联剂环氧氯丙烷添加量0.4g/100mL，考察不同添加量的甘油(G)、山梨醇(S)、聚乙二醇(PEG)200和甘油/聚乙二醇400(3：1)复合物(M)对膜性能的影响。结果如图1～3所示。

图 2 增塑剂对膜断裂伸长率的影响Fig.2 Effect of plasticizers on elongation of the f ilm

图 3 增塑剂对膜水蒸气透过系数的影响Fig.3 Effect of plasticizers on WVP of the f ilm

在本实验中，增塑剂S、PEG200和M的添加量过低时所成的膜刚性较强，易碎，无法进行性能测试。由图1、2可知，添加同种增塑剂制成的膜，随着其添加量的增大，膜机械性能的变化趋势类似：拉伸强度下降，断裂伸长率上升。这可能是由于多元醇小分子的加入降低了蛋白质分子间的相互作用。当增塑剂添加量相同时，S膜的拉伸强度最大，G膜的拉伸强度最小，断裂伸长率的情况正好相反。由图3可知，添加同种增塑剂制成的膜，随着其添加量的增大，膜的WVP值均增加，这是由于增塑剂的加入增加了蛋白质分子之间的空间，水蒸气更易透过。当增塑剂添加量相同时，G膜的WVP值最高，其他三种膜的WVP值均低于G膜，这可能是由增塑剂的分子量和吸水性不同引起的。

综合分析发现，与其他3种膜相比，M膜的各项性能指标较好，并在添加量为3g/100mL时具有较高的拉伸强度和断裂伸长率，以及较低的WVP值，因此，选择3g/100mL的甘油/聚乙二醇400(3：1)混合增塑剂为宜。

2.1.3 增强剂种类和添加量的确定

增强剂可与成膜基质紧密地结合，从而改善膜的性能。不同种类的增强剂的分子质量不同，且与蛋白质分子有着不同的相容性，从而有不同的增强作用；同种增强剂在不同添加量时与蛋白质分子间的结合强度不一样，因此增强剂的种类和添加量对膜的性能有一定的影响。

固定蛋白质添加量10g/100mL、增塑剂添加量3g/100mL、交联剂环氧氯丙烷添加量0.4g/100mL，考察不同增强剂对膜性能的影响。结果如图4所示。

图 4 增强剂对膜拉伸强度(A)、断裂伸长率(B)、水蒸气透过系数(C)的影响Fig.4 Effect of intensif iers on tensile strength (A), elongation (B),WVP (C) of the f ilm

由图4A、4B可知，与对照相比，添加同种增强剂制成的膜，其拉伸强度随增强剂添加量的增加先上升后下降，在0.6g/100mL处达最大值，而膜的断裂伸长率呈下降趋势，但其变化趋势从0.6g/100mL处开始变缓；增强剂添加量相同时，添加了CMC-Na膜的拉伸强度最大，其次是添加了海藻酸钠的膜，最后是添加了壳聚糖的膜，断裂伸长率的情况与之相同，这说明CMC-Na对膜机械性能的改善效果最好。由图4C可知，与对照相比，膜的WVP值随增强剂添加量的增加先上升后下降，并且添加了壳聚糖的膜的WVP值显著高于其他两种膜的WVP值。综合考虑膜的各性能指标，确定0.6g/100mL的CMC-Na为较适增强剂。

2.1.4 交联剂种类和添加量的确定

交联剂的加入可以加强蛋白质分子间或分子内的键合作用，从而提高膜的机械性能和阻隔性能。不同种类的交联剂与蛋白质分子发生的交联作用不同，如戊二醛中羰基与蛋白质分子中氨基的反应、磷酸钙中Ca2＋与蛋白质中的氨基酸或肽形成络合物等；同种交联剂的添加量不同时，交联反应进行的程度不同，分子间形成的交联键的数量也不同，因此需要确定最适的交联剂及其添加量。

固定蛋清蛋白质添加量10g/100mL、增塑剂添加量3g/100mL、增强剂添加量0.6g/100mL，考察不同交联剂对膜性能的影响。结果如图5～7所示。

由图5～7可看出，与对照相比，不同交联剂的加入使膜的拉伸性能和阻湿性能发生了类似的变化：拉伸强度增大，断裂伸长率下降，WVP值下降，这说明3种交联剂小分子均与蛋白质分子产生了键合作用，使膜变得更加致密，从而提高了膜的拉伸强度和阻湿性能。由上述图亦可以看出，膜性能的变化趋势是随着交联剂添加量的增加而逐渐变缓，这可能与蛋白质中的氨基酸含量和结构有关，它们决定了成膜过程中交联反应进行的程度和键合作用的强度。

图 5 环氧氯丙烷对膜拉伸(A)性能和WVP(B)的影响Fig.5 Effect of epichlorohydrin on tensile properties (A) and WVP (B) of the f ilm

图 6 戊二醛对膜拉伸性能(A)和WVP(B)的影响Fig.6 Effect of glutanaldehyde on tensile properties (A) and WVP (B) of the f ilm

图 7 磷酸钙对膜拉伸性能(A)和WVP(B)的影响Fig.7 Effect of calcium phosphate on tensile properties (A) andWVP (B) of the f ilm

通过分析不同种类的交联剂在最佳添加量时的实验结果可知，添加了环氧氯丙烷的膜的拉伸性能和阻湿性能最好，其次是添加了戊二醛的膜，最后是添加了磷酸钙的膜，因此确定0.6g/100mL的环氧氯丙烷为较适交联剂。

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

表 2 响应面试验因素水平表Table 2 Factors and levels in response surface design

在单因素试验的基础上，利用Design-Expert分析软件，采用Box-Behnken设计试验，以蛋清蛋白添加量(X1)、增塑剂添加量(X2)、增强剂添加量(X3)和交联剂添加量(X4)为自变量，以拉伸强度(Y1)、断裂伸长率(Y2)和水蒸气透过系数(Y3)为响应值，对纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜的工艺条件进行优化。因素水平表见表2，试验结果见表3。

表 3 响应面试验方案及结果Table 3 Design and results of response surface tests

2.2.2 回归模型建立及显著性检验

利用Design-Expert软件对表3中的试验数据进行二次多项回归拟合，获得复合膜拉伸强度(Y1)、断裂伸长率(Y2)和水蒸气透过系数(Y3)的回归方程如下：

Y1＝3.77＋0.18X1＋0.015X2－0.18X3＋0.33X4＋0.034X1X2＋0.011X1X3－0.071X1X4－0.020X2X3＋0.013X2X4－0.028X3X4－0.049X12＋0.011X22－1.13X32－0.24X42

Y2＝44.30－9.70X1＋10.41X2－6.82X3－5.99X4－2.65X1X2＋1.57X1X3＋1.93X1X4－0.97X2X3－0.70X2X4＋1.90X3X4＋4.85X12－3.11X22＋3.98X32＋3.12X42

Y3＝6.67＋1.87X1＋2.35X2＋0.52X3－3.01X4－0.11X1X2－0.072X1X3－0.25X1X4＋0.20X2X3－0.58X2X4－0.48X3X4＋1.30X12＋1.56X22－0.99X32＋1.80X42

由表4可以看出，该三个模型回归均极显著(P＜0.0001)，失拟项在P＝0.05水平上不显著(P＞0.05)，R2Adj分别为0.9657、0.9888、0.9816，这表明该模型的拟合度较好，能很好地分析和预测膜拉伸强度随工艺条件的变化情况。同时，较低的离散系数(CV＝3.67%、2.60%、5.24%)也说明整个试验具有较好的精确度和可靠性。

表 4 拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过系数回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the f itted quadratic model of tensile strength, elongation, WVP

2.2.3 响应面分析

表 5 各性能指标的回归方程系数及显著性检验结果Table 5 Analysis results of signif icance tests for the regression coeff icients of f ilm properties

由表5可知，蛋清蛋白添加量、增强剂添加量和交联剂添加量是影响膜拉伸强度的主要因素，膜的拉伸强度的响应面见图8。从结果来看，响应值随着增强剂及交联剂添加量变化幅度较大，而蛋清蛋白添加量对响应值的影响较小。当蛋清蛋白添加量在较低水平时，增强剂、交联剂对拉伸强度的影响比较显著，膜拉伸强度随增强剂添加量的增大先上升后下降，交联剂添加量维持在高水平时膜具有较高的拉伸强度，在低水平时拉伸强度则较低。

从表5可以看出，蛋清蛋白添加量和增塑剂添加量是影响膜断裂伸长率的主要因素，膜断裂伸长率的响应面见图9。当蛋清蛋白添加量在较高水平时，增塑剂对断裂伸长率的影响比较显著，膜断裂伸长率随着增塑剂添加量的增加而增大。响应面的响应值在蛋清蛋白添加量8～9g/100mL，增塑剂添加量3.3～3.5g/100mL范围内较高。

由表5分析可知，蛋清蛋白添加量、增塑剂添加量和交联剂添加量是影响膜透水性的主要因素，膜WVP值的响应面见图10。从图10可看出，随着蛋清蛋白和增塑剂添加量的降低，蛋白膜的透水性呈降低趋势，但随着交联剂添加量的降低，蛋白膜的透水性却呈上升趋势，且变化幅度较大，这说明交联剂对响应值的影响更大。当维持高交联剂添加量、低增塑剂添加量或低蛋白质添加量时，制成的膜有较小的透水性。

图 8 两因素交互作用对拉伸强度的影响Fig.8 Effect of the interaction of the two factors on TS

图 9 蛋清蛋白、增塑剂添加量对断裂伸长率的影响Fig.9 Effect of albumin and plasticizer content on elongation

图 10 两因素交互作用对WVP的影响Fig.10 Effect of cross-interaction between two factors on WVP of the f ilm

2.2.4 复合膜制膜工艺的优化与验证

利用Design-Expert软件，通过对3个回归方程进行联合求解，得纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜TS、E的最大值分别为3.569MPa、59.784%，WVP的最小值为5.367g·mm/(m2·d·kPa)，此时的制备工艺参数为：蛋清蛋白添加量8g/100mL、增塑剂添加量3.09g/100mL、增强剂添加量0.55g/100mL、交联剂添加量0.71g/100mL。为了进一步验证回归方程的准确性和有效性，在最佳工艺条件下制备蛋白膜，并进行性能测定，膜各性能指标分别为：拉伸强度(3.492±0.183)MPa、断裂伸长率(58.300±2.415)%、水蒸气透过系数(5.570±0.077)g·mm/(m2·d·kPa)，与预测值相近，可见回归模型能很好地预测膜的性能，优化结果可靠。

3 结 论

采用单因素试验及响应面分析法对纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜的TS、E和WVP 3个响应值建立了数学模型，并对其制备工艺条件进行了优化，得到的最优工艺条件为蛋清蛋白添加量8g/100mL、增塑剂添加量3.09g/100mL、增强剂添加量0.55g/100mL、交联剂添加量0.71g/100mL，在此条件下各性能的预测值分别为3.569MPa、59.784%、5.367g·mm/(m2·d·kPa)，验证值为(3.492±0.183)MPa、(58.300±2.415)%、(5.570±0.077)g·mm/(m2·d·kPa)。所得的回归模型拟合程度良好，并具有较好的预测性，优化结果可靠。

本实验采用响应面分析法对影响纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜性能的各因素进行了有效的分析，并优化了复合膜的制备工艺条件，可为蛋清蛋白在可食膜方面的实际应用提供基础数据和有益参考，但各因素对膜性能的影响的深层次机理尚待进一步研究。

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