响应面法优化超声波处理纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜液的制备

郑 优，郭 婷，陈厚荣，汪学荣

(西南大学，重庆 400716)

可食性膜(edible films)是指以天然可食性物质(如多糖[1]、蛋白质[2]等)为原料，添加增塑剂、交联剂等成膜助剂，通过不同分子间的相互作用而形成的薄膜。蛋清蛋白是一种营养丰富、来源广泛的蛋白质，其含有人体所需的8种必需氨基酸，尤其是含硫氨基酸较多[3]。作为一种重要的食品加工原料，蛋清蛋白具有许多重要的功能特性，如溶解性、起泡性和成膜性等。近年来，国内外学者已对其部分功能特性作了很多有益的研究[4-5]，但对以蛋清蛋白为成膜主料的可食膜的研究鲜见报道。

近年来，国内外的纳米技术得到了迅速发展，制备纳米粒子的技术日趋成熟，将无机纳米粒子应用于高分子材料[6]、医学[7]、传感器等领域的研究也取得了长足进展。同时，纳米技术的应用也为可食性膜的制备提供了一种新方法。有研究表明，纳米微粒的加入使可食膜的机械性能[8]、阻隔性能[9]及抗菌性能[10]得以改善。

蛋白基可食性膜的机械性能和阻隔性能较差，一定程度上限制了其在实际生产中的应用。近年来，国内外学者已尝试采用各种方法如物理[11-13]、酶法[14-15]、共混[16]等来改善蛋白膜的性能。目前，超声波技术也被应用于可食性膜的制备中。Bae等[17]研究了超声破碎对鱼胶蛋白纳米复合膜性能的影响，结果表明超声处理改善了膜的机械性能和阻隔性能。Marcuzzo等[18]研究了超声波作用对面筋蛋白膜性能的影响，结果表明超声波处理提高了面筋蛋白的溶解性和表面疏水性，改善了面筋蛋白膜的机械性能和阻湿性能。本实验以蛋清蛋白为原料，采用流延法制备分散均匀的纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜，并以超声功率、超声时间与间歇时间比、工作时间为因素，采用响应面分析法对超声处理条件进行优化，探讨各因素对膜机械性能和阻隔性能的影响，以期为制备性能优良的蛋清蛋白可食性膜提供基础数据和有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛋清粉(BR级) 成都西亚化工股份有限公司；纳米SiOx粉体(粒径15～20nm) 舟山明日纳米材料技术有限公司；甘油、聚乙二醇400(均为分析纯) 重庆市迎龙化工有限公司；环氧氯丙烷、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(均为分析纯) 成都市科龙化工试剂厂；色拉油购于重庆永辉超市。

1.2 仪器与设备

手持式测厚仪(0.001mm)、XYW(L)-PC智能电子拉力测试机 济南兰光机电技术有限公司；DK-8D三孔电热恒温水槽 上海齐欣科学仪器有限公司；90-2型定时恒温磁力搅拌器 上海沪西分析仪器厂；KQ2200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；JJ-1型増力电动搅拌机 金坛市富华仪器有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；JY96-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜的制备工艺流程

膜液配方：蛋清蛋白8 g/1 0 0 m L，纳米S i Ox0.1g/100mL，增塑剂甘油/聚乙二醇400(3/1)3g/100mL，增强剂CMC-Na 0.55g/100mL，交联剂环氧氯丙烷0.71g/100mL。

原辅料→溶解→磁力搅拌(30min)→水浴加热搅拌→过滤→超声处理→成膜→干燥→揭膜→贮存→测试

1.3.2 膜性能测定

1.3.2.1 膜厚(FT)

用测厚仪在待测膜上随机取5点测定，结果以平均值±标准差表示，膜厚单位为mm。

1.3.2.2 拉伸强度(TS)与断裂伸长率(E)

参照GB/T 13022—1991《塑料薄膜拉伸性能试验方法》的规定，用智能电子拉力测试机测定。采用哑铃Ⅱ形试样测试，试样宽度6mm，标距25mm，实验速率50mm/min，每个试样均作3个平行，结果以平均值±标准差表示。拉伸强度(TS)和断裂伸长率(E)分别按式(1)、(2)计算[19]：

式中：TS为拉伸强度/MPa；p为试样断裂时的最大负荷/N；b为试样宽度/mm；d为试样厚度/mm。

式中：E为断裂伸长率/%；L0为试样原始标线距离/mm；L为试样断裂时标线间距离/mm。

1.3.2.3 水蒸气透过系数(WVP)

参照GB 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸汽性试验方法：杯式法》的规定，采用拟杯子法测定。常温条件下膜一侧以烘干的无水氯化钙维持水蒸气分压为0kPa，即RH为0，膜另一侧RH为65%(以饱和NaNO2溶液保持)，按式(3)计算[20]：

式中：W V P 为水蒸气透过系数/(g ·m m/(m2·d·kPa))；ΔW为时间t内水蒸气透过量/g；FT为膜厚/mm；s为膜面积/m2；t为测试时间/d，本实验为2d；ΔPV为膜两侧水蒸气压差/kPa。

1.3.2.4 透油系数(PO)[21]

将5mL色拉油加入试管中，以待测膜封口，倒置于滤纸上，在密闭环境中放置2d，称量滤纸质量的变化，按式(4)计算：

式中：PO为透油系数/(g·mm/(m2·d))；ΔW为时间t内滤纸质量的变化/g；FT为膜厚/mm；s为膜面积/m2；t为测试时间/d，本实验为2d。

1.3.3 试验设计

1.3.3.1 单因素试验设计

选取超声功率、超声时间与间歇时间比、工作时间为试验因素，研究这3个因素对膜的TS、E、WVP和PO的影响效果。试验均作3个平行，结果以平均值±标准差表示。

1.3.3.2 响应面试验设计

在单因素试验基础上，以膜的TS、E、WVP和PO为响应值，利用响应面分析软件，制定三因素三水平的Box-Behnken试验设计，并对各个指标进行工艺参数优化。

1.3.3.3 数据统计与分析

利用Design-Expert 8.05对响应面试验结果进行线性回归和方差分析(P＜0.05)，每个试验处理均作3个平行，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 超声功率对纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜性能的影响

超声功率是表示超声波强度的物理量，对膜性能有一定的影响。随着超声功率的增加，超声波强度增大，空蚀作用加剧，膜基质分子受到交替膨胀和压缩的力增大，分子结构被破坏，分子链变短并充分伸展，分子间相互作用加强，有利于分子间网络结构的形成；但当超声功率过高时，大量的化学键会断裂，同时由于空蚀效应的高温高压作用生成高度反应性自由基，引发一系列化学反应，杂乱无章的相互作用使蛋白质分子间难以形成有序的结构，从而不利于形成结构致密的膜，故需要确定合适的超声功率。

按上述配方制备膜液7份，其中一份作为对照。固定超声时间与间歇时间比1：1、工作时间15min，考察不同超声功率(0、50、100、150、200、250、300W)对膜性能的影响，结果如图1所示。

图 1 超声功率对膜拉伸强度和断裂伸长率(A)和膜阻隔性能(B)的影响Fig.1 Effect of ultrasound power on the TS and elongation at break of the f ilm

由图1可看出，随着超声功率的提高，膜的拉伸强度呈上升趋势，膜的断裂伸长率、水蒸气透过系数和透油系数均呈下降趋势，这可能因为超声波处理的空化作用、机械作用和超混合效应使蛋白质大分子中的一些化学键断裂，许多反应基团暴露，分子间的相互作用增强，形成立体网络结构，同时粒子大小降低，所得的膜液更均匀，从而可得到更加坚韧、致密的膜。在超声功率为200W时，膜的拉伸强度达最大值4.93MPa，比对照提高了33.97%；断裂伸长率达最小值40.5%，比对照降低了29.20%；水蒸气透过系数和透油系数分别达最小值2.99g·mm/(m2·d·kPa)和0.748g·mm/(m2·d)，分别比对照降低了37.71%和38.33%。当超声功率超过200W时，膜的拉伸强度不再上升而有所下降，断裂伸长率、水蒸气透过系数和透油系数有所上升，这是因为膜液中不再产生新的结合点，大分子间的相互作用趋于饱和，同时超声功率过高时造成的高温高压作用不利于蛋白质分子间有序结构的形成。综合考虑膜的各项性能指标，确定200W为最适超声功率。

2.2 超声时间与间歇时间比对纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜性能的影响

在超声功率和工作时间一定的情况下，超声时间与间歇时间比对膜的性能有一定的影响。超声时间与间歇时间比越大，膜液中分子受到交替膨胀和压缩的时间就越多，更多的极性基团暴露出来，膜液中原有的氢键和疏水结合被打破，各大分子间重新形成各种非极性键，有利于形成结构致密的膜。

按上述配方制备膜液6份，固定超声功率200W、工作时间15min，超声时间与间歇时间比分别设置为1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1，考察其对膜性能的影响，结果如图2所示。

图 2 超声时间与间歇时间比对膜机械性能(A)和阻隔性能(B)的影响Fig.2 Effect of ultrasound working/intermittence time ratio on mechanical and barrier properties of the f ilm

从图2可看出，随着超声时间的延长，膜的拉伸强度先上升后下降，而断裂伸长率、水蒸气透过系数和透油系数先下降后上升，这可能是因为超声功率与工作时间一定时，随着超声部分时间的延长，更多的反应基团暴露，蛋白质中原有的氢键、二硫键等化学键断裂，各大分子间重新形成新的化学键，网络结构更加致密。当超声时间与间歇时间比为2：1时，膜的拉伸强度达最大值5.04MPa，断裂伸长率、水蒸气透过系数和透油系数均达最小值，分别为39.4%、2.86g·mm/(m2·d·kPa)和0.711g·mm/(m2·d)。当超声时间与间歇时间比超过2：1时，膜的拉伸强度略有下降，断裂伸长率、水蒸气透过系数和透油系数有所上升，故选择2：1为最适超声时间与间歇时间比。

2.3 工作时间对纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜性能的影响

工作时间在一定程度上也会影响膜的性能。固定超声功率和超声时间与间歇时间比，随着工作时间的延长，超声波的空化作用、机械作用和超混合效应越好，分子间的相互作用更充分，同时膜液的粒子大小降低，所得的膜液更均匀，因而能制得表面平整、结构致密的膜。

按上述配方制备膜液6份，固定超声功率为200W，超声时间与间歇时间比为2：1，工作时间分别设置为5、10、15、20、25、30min，考察其对膜性能的影响，结果如图3所示。

图 3 工作时间对膜机械性能(A)和阻隔性能(B)的影响Fig.3 Effect of ultrasound treatment time on mechanical and barrier properties of the f ilm

由图3可看出，随着工作时间的延长，膜的拉伸强度呈上升趋势，断裂伸长率、水蒸气透过系数和透油系数呈下降趋势，当工作时间超过20min后，拉伸强度的上升趋势和断裂伸长率、水蒸气透过系数、透油系数的下降趋势均逐步放缓。这是因为超声波处理的空化作用使蛋白分子中的次级键(氢键和二硫键)被打开，表面巯基含量增加，形成新的二硫键，同时超声波的机械作用使更多的反应基团暴露，蛋白质分子内和分子间的相互作用增强，形成较强的网络结构，因此在一定范围内，工作时间对膜性能的影响显著，同时由于适当的工作时间足以使膜液形成均匀、致密的精细网络结构，故之后继续延长工作时间对膜性能的影响并不大。从图3可知，工作时间为20min时，膜的拉伸强度为5.19MPa，断裂伸长率、水蒸气透过系数、透油系数分别为37.9%、2.65g·mm/(m2·d·kPa)、0.673g·mm/(m2·d)，膜的各项性能较佳，故选择20min为最适工作时间。

2.4 响应面试验优化

2.4.1 响应面试验设计及结果

在单因素试验的基础上，利用Design-Expert分析软件，采用Box-Behnken试验设计，以超声功率、超声时间与间歇时间比、工作时间为自变量，以拉伸强度(Y1)、断裂伸长率(Y2)、水蒸气透过系数(Y3)和透油系数(Y4)为响应值，对纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜的超声处理条件进行优化。因素水平表见表1，试验结果见表2。

表 1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

表 2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental scheme and results for response surface analysis

2.4.2 回归模型建立及显著性检验

利用Design-Expert软件对表3中的试验数据进行二次多项回归拟合，获得复合膜拉伸强度(Y1)、断裂伸长率(Y2)、水蒸气透过系数(Y3)和透油系数(Y4)的回归方程如下：

Y1＝5.21＋0.021X1＋0.00375X2＋0.083X3－0.0025X1X2＋0.010X1X3＋0.020X2X3－0.14X12－0.088X22－0.11X32

Y2＝37.16－0.40X1＋0.21X2－1.04X3－0.025X1X2＋0.025X1X3－0.35X2X3＋2.12X12＋1.95X22＋1.00X32

Y3＝2.67－0.034X1＋0.030X2－0.14X3＋0.002X1X2＋0.0025X1X3＋0.001X2X3＋0.17X12＋0.16X22＋0.11X32

Y4＝0.6 7－0.0 0 7 X1＋0.0 1 0 X2－0.0 3 1 X3－0.00275X1X2－0.00275X1X3＋0.004X2X3＋0.044X12＋0.036X22＋0.027X32

表 3 拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过系数、透油系数回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the f itted quadratic models of tensile strength, elongation at break, WVP and PO

由表3可以看出，该4个模型回归均显著(P＜0.01)，失拟项在P＝0.05水平上不显著(P＞0.05)，R2Adj分别为0.9269、0.9461、0.8519、0.9193，这表明该模型的拟合度较好，能很好地分析和预测膜拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过系数和透油系数随超声波处理条件的变化情况。同时，较低的离散系数(CV＝0.67%、1.09%、2.37%、1.68%)也说明整个试验具有较好的精确度和可靠性。

2.4.3 响应面分析

由表4可知，工作时间是影响膜拉伸强度的主要因素，膜的拉伸强度的响应面见图4。从结果来看，响应值随着工作时间变化幅度较大，而超声功率和超声时间与间歇时间比对响应值的影响较小。超声功率或超声时间与间歇时间比不变时，随着工作时间的延长膜的拉伸强度不断上升，均表现为响应面曲线较陡，二者的交互作用显著，且两个响应面均存在极大值。

表 4 各性能指标的回归方程系数及显著性检验结果Table 4 Regression coeff icient and statistical signif ciance of each term in the quadratic models of tensile strength, elongation at break, WVP and PO

从表4可以看出，超声功率和工作时间是影响膜断裂伸长率的主要因素，膜的断裂伸长率的响应面见图5。当超声功率在较低水平时，工作时间对断裂伸长率的影响比较显著，膜断裂伸长率随着工作时间的延长而显著下降。在超声功率150～175W、工作时间15～21min时的响应面坡面极陡，且响应面存在极值，二者的交互作用显著。

由表4还可知，工作时间是影响膜水蒸气透过系数的主要因素，膜的水蒸气透过系数的响应面见图6。从结果来看，响应值随着工作时间变化幅度较大，而超声功率和超声时间与间歇时间比对响应值的影响较小。从图6可看出，超声功率或超声时间与间歇时间比不变时，随着工作时间的延长膜的水蒸气透过系数显著下降，均表现为响应面曲线较陡，二者的交互作用显著，且两个响应面均存在极小值。

从表4可以看出，超声时间与间歇时间比、工作时间是影响膜透油系数的主要因素，膜的透油系数的响应面见图7。当超声时间与间歇时间比在较低水平时，工作时间对透油系数的影响比较显著，膜透油系数随着工作时间的延长而显著下降。在超声时间与间歇时间比1～1.5、工作时间15～21min时的响应面坡面极陡，且响应面存在极小值，二者的交互作用显著。

图 4 超声时间与间歇时间比、超声功率、工作时间对拉伸强度的影响Fig.4 Response surface plot showing the effect of ultrasound working/intermittence time ratio, ultrasound power and treatment time on TS

图 5 超声功率、工作时间对断裂伸长率的影响Fig.5 Response surface plot showing the effect of ultrasound power and treatment time on E

图 6 超声功率、超声时间与间歇时间比、工作时间对水蒸气透过系数的影响Fig.6 Response surface plot showing the effect of ultrasound power,ultrasound working/intermittence time ratio and treatment time on WVP

图 7 超声时间与间歇时间比、工作时间对透油系数的影响Fig.7 Response surface plot showing the effect of ultrasound working/intermittence time ratio and treatment time on PO

2.4.4 复合膜制膜工艺的优化与验证

利用Design-Expert软件，通过对4个回归方程进行联合求解，得纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜TS、E的最大值分别为5.141MPa、38.401%，WVP的最小值为2.719g·mm/(m2·d·kPa)，PO的最小值为0.620g·mm/(m2·d)。此时的超声处理条件为：超声功率205.67W、超声时间与间歇时间比1.13：1、工作时间23.32min。为了进一步验证回归方程的准确性和有效性，在最佳超声处理条件下制备蛋白膜，并进行性能测定，膜各性能指标分别为：拉伸强度(5.092±0.146)MPa、断裂伸长率(37.560±3.409)%、水蒸气透过系数(2.961±0.083)g·mm/(m2·d·kPa)，透油系数为(0.667±0.006)g·mm/(m2·d)，与预测值相近，可见回归模型能很好地预测膜的性能，优化结果可靠。

3 结 论

超声波处理复合膜液后，纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜的机械性能和阻隔性能均有所改善。超声功率和工作时间是影响膜机械性能的主要因素，而超声时间与间歇时间比和工作时间是影响膜阻隔性能的主要因素。通过单因素试验及响应面分析法对纳米SiOx/蛋清蛋白复合膜的TS、E、WVP和PO共4个响应值建立了数学模型，并对其超声处理条件进行了优化，得到的最优超声处理条件为：超声功率205.67W、超声时间与间歇时间比1.13：1、工作时间23.32min，在此条件下各性能的预测值分别为5.141MPa、38.401%、2.719g·mm/(m2·d·kPa)、0.620g·mm/(m2·d)，验证值为(5.092±0.146)MPa、(37.560±3.409)%、(2.961±0.083)g·mm/(m2·d·kPa)、(0.667±0.006)g·mm/(m2·d)。所得的回归模型拟合程度良好，并具有较好的预测性，优化结果可靠。

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