罗非鱼加工废水微生物除臭处理的研究

张志强，李永成，易美华

（海南大学食品学院，海南海口570228）

目前，我国罗非鱼加工产品主要是冻鱼片和冻全鱼两大类[1]，在生产过程中产生大量的下脚料，其重量约占原料鱼的40%～50%[2]，其中含有14.8%的粗蛋白，10.75%的粗脂肪，5.74%的灰分[3]。这些下脚料一般被加工成鱼粉，此过程中会产生一定量含3%～5%蛋白质的废水，海南气温较高，这些废水在腐败菌的作用下，排放后3～5h内产生恶臭，严重影响周围大气与水体环境。因含有一定量的蛋白质，它们有一定的利用价值，如可用来生产含氨基酸液体肥。但在实现其资源化前，必需首先对其进行除臭处理。据报道[4-5]，恶臭物质主要包括蛋白质和氨基酸经过脱羧及脱氨作用形成的含氮化合物，如：氨气（NH3）、胺类（腐胺、尸胺、组胺、三甲胺等）、酰胺、吲哚和含氧有机物，如中间产物醛类、酮类、醚类。另外还有脂肪分解成的挥发性脂肪酸，含硫氨基酸分解产生的硫化氢、硫醇和硫醚等。并且可能引起人身体上的不适，对人体呼吸、消化、心血管、内分泌及神经系统都会造成不同程度的毒害，有些芳香族化合物甚至使人体产生畸变、癌变[6]。而对于恶臭的控制分为两类：a.主动控制：恶臭物质产生之前，采取措施控制恶臭物质的形成；b.被动控制：对已经产生的恶臭气体进行收集和处理[7]。本研究采用微生物处理技术，通过接种特定微生物，将罗非鱼加工废水中的蛋白质分解成小肽和氨基酸。避免腐败菌利用其中的蛋白质形成臭味物质，主动控制恶臭气体的产生，从而达到生物抑臭脱臭的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米曲霉（Aspergillus oryzae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、生物除臭剂 购自北京意科乐生态科技有限公司，主要成分为含有各种除臭功能的微生物；罗非鱼加工废水 取自海南省海南泉溢食品有限公司，存于4℃下冰箱中备用，经测定，其主要成分参数为：干物质含量10.67%，pH6.48，蛋白质含量6.2%，脂肪含量0.54%，氨基氮0.3%。

TCYQ型摇床 太仓市实验设备厂；HH-4型数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；超净工作台 苏州佳宝净化工程设备有限公司；手提式高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SHZ-D（III）型循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；雷磁PHS-3C型酸度计、723N型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；低速离心机 常州市华普达教学仪器有限公司。

1.2 培养基的配制

1.2.1 发酵培养基 以罗非鱼加工废水为基础，自然pH，121℃灭菌20min备用。

1.2.2 液体种子培养基 PDA培养基和肉汤培养基，121℃灭菌20min备用。

1.3 实验方法

1.3.1 种子制备 将活化的米曲霉菌接种到PDA液体培养基中，活化的枯草芽孢杆菌接种到肉汤液体培养基中，两者均于180r/min，30℃下振荡培养48h备用。

1.3.2 摇瓶发酵 将上述1.2项中的发酵培养基分装于7个500mL三角瓶中，每瓶100mL；3瓶加3%葡萄糖，分别接种3mL上述1.3.1项中米曲霉和枯草芽孢杆菌种子液和3mL生物除臭剂；3瓶不加葡萄糖，分别接种3mL上述1.3.1项中米曲霉和枯草芽孢杆菌种子液和3mL生物除臭剂；1瓶作为空白对照。以上瓶口均覆盖六层纱布，于30℃、200r/min条件下在恒温摇床中连续发酵36h。发酵结束后测定蛋白质的含量。并于室温下继续放置，每隔2d测定一次挥发性盐基氮含量、pH以及对臭味进行感官评定。

1.4 测定方法

1.4.1 蛋白质含量测定 分光光度法[8]：根据国家标准GB 5009.5—2010中的分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氢化吡啶化合物，在波长400nm下测定吸光度值，与标准品比较定量。

本研究中采用TCA沉淀法预处理提取废水中的蛋白质：取一定量的发酵液与10% TCA混合，100℃水浴10min，蛋白质与TCA充分结合，3000r/min离心，弃去上清液，沉淀用无水乙醇洗涤后3000r/min再离心，弃去上清液后，蒸馏水少量多次洗涤沉淀于消化管中进行消化。

1.4.2 挥发性盐基氮含量测定 乙酰丙酮-甲醛分光光度法[9]：蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质，是蛋白质腐败产生的重要臭味物质，这类物质可以与废水中有机酸结合，形成一种称为盐基态氮（+NH4·R-）的物质，在pH 5～6的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氢化吡啶化合物，在波长412nm处测定吸光度值，与标准品比较定量。

1.4.3 臭味的感官评定 臭味等级描述法[10]（flavor rating assessment，FRA）与综合评分法，该方法适用于天然水、饮用水、生活污水和工业废水中臭的检测，见表1。表1中，0分表示无臭味；1分表示微弱的臭味，勉强感觉存在（嗅觉阀值）；2分表示弱的臭味，确认存在（认知阀值）；3分表示明显的臭味，极易感觉存在；4分表示很强的臭味，明显存在；5分表示很强烈的臭味，难以忍受。嗅觉阀值是指人们勉强能够嗅出气味的最小浓度；认知阀值是指人们勉强能够分辨出气味性质的最小浓度。

表1 臭味等级强度描述Table 1 Description of odor grade and strength

2 结果与讨论

2.1 各处理废水中蛋白质含量的变化

废水中的蛋白质被腐败性细菌分解产生胺类化合物而产生恶臭味，因此要最大限度地消除废水中的蛋白质。本研究选用枯草芽孢杆菌、米曲霉、生物除臭剂对废水进行处理。结果表明（图1）废水蛋白质含量均有所下降，但存在差异，说明各微生物产生蛋白酶能力不同，对废水中蛋白的分解利用程度有所不同。其中以枯草芽孢杆菌处理的废水中蛋白质消除率最大，这与枯草芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶有关[11]，而米曲霉的蛋白酶酶系主要以中性蛋白酶为主[12]。在前人实验中[13-14]，碱性蛋白酶对罗非鱼鱼肉的综合分解效果最好。在废水中加入适当的C源（葡萄糖），有利于蛋白质的消除。这是由于葡萄糖的添加为微生物的繁殖提供了丰富的C源，从而使微生物大量繁殖，有利于产生蛋白酶；当添加葡萄糖时，利用枯草芽孢杆菌处理，蛋白质从对照的4.5g/100mL降低到0.8g/100mL。

图1 不同处理废水蛋白质残留量Fig.1 Protein residue with different processing method

2.2 挥发性盐基氮含量的变化

由于罗非鱼加工废水中含有大量的蛋白质，在杂菌的作用下产生臭味物质胺类，如腐胺、尸胺、色胺、组胺、三甲胺、甲胺、乙胺、丙胺、吲哚等物质，他们绝大多数属于挥发性盐基氮，因此挥发性盐基氮含量是判断废水臭味的一个重要指标。图2表明废水经生物处理后，在室温放置过程中，废水中挥发性盐基氮的变化情况。

图2 不同处理中挥发性盐基氮含量随放置天数的变化Fig.2 The change of TVB-N content with the time

废水中主要是蛋白质和少量脂肪，糖类物质极少。废水中未加糖时（图2A），各处理挥发性盐基氮的变化与对照均没明显区别，说明未加糖时，废水中微生物生长缺乏C源，生长受到限制，没有很好分解蛋白质。在加糖的各种处理组（图2B）中，挥发性盐基氮均比对照及未加糖处理组（图2A）要低，主要是由于废水缺少C源，废水补充糖类后，有利于处理菌的生长，形成优势菌群，充分分解利用蛋白质和脂肪，使之成为小分子物质，抑制腐败菌的生长，控制臭味物质的产生。三种加糖处理的废水在放置3d，挥发性盐基氮没明显区别（图2B）。但放置3d后，米曲霉处理的挥发性盐基氮出现上升（图2B），是由于该处理蛋白质降解不完全（图1中A处理），随时间延长，腐败菌利用剩下的蛋白产生挥发性盐基氮；而除臭剂与枯草芽孢杆菌处理的挥发性盐基氮没上升趋势，说明该处理蛋白质分解完全（图1中C与E处理）或形成生长优势，抑制腐败微生物生长。枯草芽孢杆菌处理的挥发性盐基氮在5d后还出现了下降趋势，主要原因是其挥发性盐基氮的产生受到了限制，同时海南天气室温比较高，可能挥发了部分挥发性盐基氮。综合看来，当添加葡萄糖，用枯草芽孢杆菌处理，挥发性盐基氮从对照的0.91g/100mL下降到0.04g/100mL，下降率95%。

2.3 pH变化

蛋白质分解产生的氨基酸在腐败菌作用下会脱羧脱酸，或产生腐败性胺，均引起废水的pH发生相应变化，对其pH的跟踪测定也能为研究臭味变化提供另一个途径。如图3，在未加葡萄糖的处理中（图3A），其pH整体趋势为上升，与挥发性盐基氮的变化（图2A）趋势是一致的，说明挥发性盐基氮可使pH上升。在后期5～7d，pH略有下降，可能是其中的盐基氮被其他微生物分解所致。但废水添加糖后，微生物生长迅速，将蛋白质分解为氨基酸，pH呈下降趋势。孔建等[15]报道，枯草芽孢杆菌在培养过程中，伴随有酸性抗菌物质的产生和积累，抑制腐败菌生长。枯草芽孢杆菌在分解蛋白成为氨基酸的同时，也可能产生了酸性物质，导致pH维持在4～5范围内。而王淑敏等[16]报道，在C源存在条件下，产酸微生物的生长与pH的降低存在动态平衡，抑制其他腐败菌的生长。在后期7d，pH虽略有升高，但仍保持酸性状态，可能是其他各种复杂微生物生长的结果。

图3 不同处理中pH随放置天数的增加的变化Fig.3 The change of pH with the increase of days

2.4 废水臭味的感官评定

根据臭味等级描述法和综合评分法对放置的废水进行感官评定，结果见表2。通过对废水臭味的嗅觉感官评定，发现随着微生物发酵处理后的废水放置时间的增加，枯草芽孢杆菌有很好地抑制臭味物质产生的能力，这跟其产生的各种酶有着密切的关系。臭味物的产生与挥发性盐基氮、pH呈正相关。

表2 各种处理后废水的臭味感官评定Table 2 Sensory evaluation of odor with different processing method

3 结论

在罗非鱼加工废水中添加米曲霉、枯草芽孢杆菌、生物除臭剂进行摇瓶发酵均能对废水中的蛋白质进行降解，同时形成优势菌群，根除腐败的根源，抑制腐败菌的生长。从蛋白质分解、挥发盐基氮及臭味的消除三方面综合考虑，枯草芽孢杆菌附加3%葡萄糖处理废水效果最好，其蛋白质分解从对照的4.5g/100mL降低到0.8g/100mL，挥发性盐基氮从对照的0.91g/100mL下降到0.04g/100mL，下降率为95%，臭味等级水平降低，达到分解有机物，控制臭味物质产生的效果。目前，面对海南省罗非鱼加工废水处理方式粗放滞后的现状，微生物除臭处理技术相对于传统的掩蔽、吸附等处理方法，具有处理效率高，处理后可进一步综合利用与资源化等优点，具有广泛的环境效益和经济效益，对海南省罗非鱼加工价值的延伸和产业技术升级有重要意义。

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