实时荧光PCR技术快速检测食品中的牛源成分

范丽丽，李培，丁洪流，金萍，傅春玲，*

（1.苏州大学医学部公共卫生学院，江苏苏州215123；2.苏州市产品质量监督检验所，江苏苏州215128）

食品的质量和安全一直是社会关注的焦点，随着人们生活水平的提高，肉制品消费已经成为食品消费的主流[1]，要确保广大消费者的切身利益，就要保证各种肉制品质量可靠。目前利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者而牟取暴利的事件屡屡出现[2]，不仅扰乱市场秩序，还给消费者的身心健康带来许多负面影响。近年来，随着肉制品食用量的增长，人们对肉品质量提出了更高的要求。由于加工肉品成分复杂，掺杂物质种类繁多，通常很难用一般的化学方法鉴别真伪[3-4]，故亟待一种快速准确的方法来鉴别肉类掺假。改革开放以来，我国居民牛肉的消费量持续增加[5]，它为人们提供丰富的营养物质，对人的生长发育、提高机体的免疫力等都具有重要的作用；同时若牛肉食品中掺入相对廉价的猪肉，冒犯了具有伊斯兰教等宗教信仰的消费者，也不利于社会和谐安定。因此，建立快速鉴别牛肉方法具有十分重要的意义。本文旨在利用Taqman实时荧光PCR技术建立一种快速、准确、可靠的定性牛源性成分的方法，以满足当前的相关食品掺假检测需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

各种含牛肉成分的市售加工食品，如清真肠、儿童牛肉酥、卤牛肉和撒尿肉丸等，以及鲜牛、猪、羊、鸡、鸭肉等通过形态鉴别 分别购自苏州各大型超市；组织基因组DNA提取试剂盒 购自天根生化科技有限公司；无水乙醇 分析纯；Taqman Universal PCR master mix 购自ABI。

表1 引物探针序列Table 1 Sequences of primers and probe

5810型台式高速冷冻离心机、生物分光光度计德国Eppendorf公司；7000型实时荧光PCR仪 美国ABI公司；DKB-1915型恒温水浴槽 IO-RAD公司；涡旋振荡器，研钵。

1.2 样品均质及基因组模板制备

采用研钵等实验器具对纯猪、牛、羊、鸡和鸭烘干（105℃）后进行均质处理，作为特异性及灵敏性实验中的标准纯品，以及制作后期模拟混合样使用，均质过程不同肉类分开处理，防止不同动物源性污染。按照组织基因组DNA提取试剂盒说明书步骤进行，最终提取OD260/OD280比值均在1.6～2.0之间的动物组织DNA。

1.3 引物、探针的设计合成

根据Genbank所公布的牛线粒体细胞色素b（Cyt b）基因序列，利用primer express 2.0软件，依据引物探针设计原则，设计牛特异性引物和探针，GeneBank Accession：HQ184045.1，扩增目的片段长度为91bp。引物探针序列见表1。

1.4 实时荧光PCR反应体系与反应循环参数

反应体系的体积为25μL：Taqman PCR master mix；上、下游引物，荧光标记探针，各1μL，终浓度皆为0.4μmol/L；模板DNA（0.001～50ng/μL）1μL；其余不足用灭菌双蒸水补齐。反应循环参数为：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环。

1.5 特异性实验

以牛、猪、羊及鸡、鸭等纯肉提取的DNA，浓度50ng/μL，各取1μL，分别进行实时荧光PCR反应，以验证所设计牛引物、探针的特异性。

1.6 灵敏度实验

取纯牛肉提取DNA，用灭菌双蒸水10倍倍比稀释，浓度10～0.001ng/μL，取1μL为模板，各浓度3个平行，进行实时荧光PCR，检测所设计牛引物、探针的灵敏度，并经实验重复验证。

1.7 模拟样品中牛源性成分检测

为进一步检测牛特异性引物探针体系，制备不同模拟混合样品，其中A类模拟样为牛、猪肉混合样品，B类为牛、羊肉混合样品，C类为牛、鸡混合样品，D类为牛、鸭肉混合样品，E类为牛、猪、羊、鸡及鸭五种纯肉混合均匀后的样品，各肉种在混合样中依次所占的质量百分比见表2。之后每个混合样提取DNA模板，各3个平行进行实时荧光PCR，以检验该引物探针体系用于模拟混合样品的检测限。

2 结果与分析

表2 模拟混合肉类样品（w/w）Table 2 Samples of meat mixture（w/w）

2.1 引物有效性验证

利用所设计的引物，对牛模板进行PCR扩增，图1中为四个重复样品，由图1可以看出，皆扩增出约91bp的DNA片段，与预期所设计目的片段长度相符。

图1 PCR产物电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of PCR products

2.2 特异性实验

为防止肉类食品中复杂成分可能抑制PCR扩增，将各种肉类DNA模板含量控制在50ng进行特异性实验[6]。如图2所示，所设计牛的引物探针体系只针对牛源性模板进行特异性扩增，Ct值达到22，且重复性良好，对其他动物源性成分，猪、羊、鸡、鸭等肉类DNA均不能扩增，后者分别用猪、羊、鸡、鸭的种特异性引物探针体系均可得到特异性扩增，可排除因DNA提取质量差或PCR抑制物所致假阴性结果（另文发表），证实该检测体系具有很好的特异性。ZHANG Chun-Lai[7]以牛线粒体细胞色素基因作为靶基因设计的检测牛DNA的普通PCR和实时荧光PCR的引物探针体系对猪、羊、火鸡、鸡等肉类样品无交叉反应，本文建立牛引物探针体系也显示对猪、羊、鸡、鸭肉类DNA无交叉扩增，可以满足市售肉类牛源性检测特异性要求。

图2 牛源性引物探针体系特异性检测Fig.2 The specificity detections of bovine primer-probe system

2.3 灵敏度实验

为了验证该体系的灵敏度，将牛DNA模板10倍倍比稀释，图3中牛DNA模板浓度依次为10、1、0.1、0.01、0.001ng/μL，其Ct值范围为18.12～32.18，且各浓度重复性好。其中浓度0.001ng/μL的模板亦获得正常扩增，可见该引物探针体系可检测到1pg的牛DNA。

图3 牛源性引物探针体系灵敏性检测Fig.3 The sensitivity detections of bovine primer-probe system

2.4 模拟混合样品中牛源性成分检测

用所建立的牛源性特异引物探针体系，对五类模拟混合肉质样品（如表2）进行检测，所有含5%～0.5%的牛肉样品均获得成功扩增，Ct值范围为21.96～28.03，可知该检测体系的检测限可低至0.5%以下。因为目的DNA含量愈高，Ct值越小。扩增结果如表4，四种类模拟混合样品的扩增结果皆呈现随牛肉成分含量降低，Ct呈增高趋势。

2.5 食品样品中牛源成分检测

为了进一步验证牛引物探针体系的准确性和实际应用能力，对购自市场的食品进行检测。各食品样品主要成分分别为清真肠：牛肉、玉米淀粉、食用大豆蛋白、食品添加剂；儿童牛肉酥：牛肉酥、盐、糖；卤牛肉：牛肉、食品添加剂等；速冻撒尿牛丸：牛肉、猪肉及鸡肉等。四类食品各做三个重复，扩增结果如图4，自左至右四组曲线依次为清真肠、牛肉酥、卤牛肉和撒尿牛丸，皆获得正常扩增，表明该体系可检测加工肉食品中所存在的牛肉成分。

表3 模拟混合肉样中牛源性成分的检测Table 3 Detections of bovine in meat mixtures

图4 食品样品牛源成分检测Fig.4 Detections of bovine in food samples

3 讨论

国内已经建立的食品肉种的检测方法存在一些应用方面的缺陷，如赵红波等[8]所建立的红外光谱技术以及田金辉等[9]的T-RFLP鉴定方法目前仅针对于生鲜肉，尚无法应用于熟牛肉以及混合肉样食品的检测。而孙艳华等[10]建立的普通PCR检测熟肉肉类来源的方法检测限为5%，灵敏性不高，同时存在耗时长、产物易污染、不能批量检测等问题[11]。Taqman实时荧光PCR技术在检测食品种源方面具有优势：其特异性有引物和探针双重保障，可避免假阳性；扩增片段短（约100bp）不受高度加工食品DNA降解的影响；而且灵敏度高、定量准确，可快速、自动化、批量检测，特别适合于成分复杂的加工食品种源检测。本文利用Taqman实时荧光PCR技术建立的牛源检测体系通过针对牛线粒体细胞色素b基因保守序列设计引物和探针，可特异检测牛源成分，而不受市售常见猪、羊、鸡鸭等肉类种源的影响，检测特异性较高；将阳性检测限设定在CT设定在35循环以内，也获得了较高的灵敏性，可检测1pg牛源DNA的存在；对于含5%～0.5%牛肉的不同类型模拟混合肉样，均可准确测定而不受其他种源肉的干扰。国外所利用实时荧光PCR方法进行肉类种源鉴定的研究中，Jonker等[12]选取牛satellite IV一段序列设计引物探针，最低仅可检测0.2ng牛DNA；Dooly等[6]同样以线粒体细胞色素b基因为目的基因，其所建立的牛源检测体系由于与其他肉种存在一定的交叉反应，为满足特异性需要，其CT限定在30循环以内，如此便限制了该体系的灵敏度。Camma等[13]以cyt b基因作为目的基因建立的牛源引物探针体系可检测0.8pg模板DNA，与本研究相近；但对于混合肉样的检测限仅达1%（CT值为27.78），高于本检测体系的检测限0.5%。因此相比国外已经建立的方法，本文建立的牛源检测体系在特异性、灵敏性上具有一定的优势。同时经对市售样品的应用性检测，可特异的检测出各种加工食品，如火腿肠、肉丸中的牛源成分，验证了该检测体系应用性较好。

本研究建立的食品中牛源性成分检测体系经验证具有较好的特异性和高灵敏度，以及很好的市场检测应用能力，具有准确、省时等特点，可作为市售食品中牛源成分检测的有效手段。

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