标准曲线法测定茯神中多糖的含量
2013-08-06黄荣花张书华
张 捷,黄荣花,张书华
(陕西省铜川市药品检验所,陕西 铜川 727031)
茯神为多孔菌科卧孔属植物茯苓 Poria cocos Schw.Wolf的菌核,原物种为低等植物,是寄生在松树上的真菌,药用部分为菌核中间抱有松根的白色部分。茯神性平,味甘、淡,有渗湿、健脾、宁心等功能,用于痰饮、水肿、小便不利、泄泻、心悸、眩晕。近年来的研究发现,茯神具有养心凝神的功效,用于心神失养所致的心悸怔忡、失眠多梦等神志不宁的虚证,并常与补血养心药同用,以增强疗效。茯神对健忘病患者也有一定的辅助治疗作用,另外对小便不利患者也有缓解作用[1]。本试验采用标准曲线法[2]测定茯神药材中多糖的含量,现报道如下。
1 仪器与试药
Evolution 500型紫外分光光度计;AY-220型电子天平。D-无水葡萄糖对照品(批号为110833-200904,中国药品生物制品检定所);茯神药材样品的产地分别为湖南、湖北大别山、陕西汉中。所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液制备
精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥14 h的 D-无水葡萄糖对照品0.0201 g,置20 mL容量瓶中,加纯化水溶解至刻度,摇匀,作为对照品贮备液(每1 mL含D-无水葡萄糖1.005 mg)。取本品粗粉约1 g,精密称定,加80%乙醇100 mL回流2 h,趁热滤过,残渣用80%热乙醇洗涤3次,每次10 mL,弃去乙醇液;将残渣及滤纸置烧瓶中,加水150 mL,在水浴锅上回流2 h,趁热滤过,用热水洗涤4次,放冷,加水定容至250 mL,即得供试品溶液。
2.2 测定方法
精密量取样品1 mL,置具塞试管中补加水至2 mL,精密加入5%苯酚溶液1 mL,迅速精密加硫酸5 mL,依法测定吸光度,计算含量。
2.3 检测波长选择
取供试品(含量为 29.982 mg/g),用 Evolution 500型紫外分光光度计进行紫外扫描,结果供试品在490 nm波长处有最大吸收。
2.4 方法学考察
标准曲线制备:精密量取对照品贮备液10 mL,置100 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,作为对照品溶液。精密量取对照品溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL 分别置具塞试管中,补加水至 2 mL,各精密加入5%苯酚溶液1 mL,摇匀,迅速精密加硫酸5 mL,摇匀,待其反应10 min,置40℃的水浴锅中保温15 min,取出后迅速冷却至室温(分别含 D - 无水葡萄 为 20.1,40.2,60.3,80.4,100.5 μg)。以对照品 0 mL 试管内的溶剂为空白,照紫外可见分光光度法(附录ⅤA),在490 nm波长处测定吸光度,以吸光度(Y)为纵坐标、质量(X)为横坐标绘制标准曲线,得回归方程Y=15.661 7 X -0.082 8,r=0.999 9。结果表明,D - 无水葡萄糖质量在20.1~100.5 μg范围内与吸光度呈良好的线性关系。
精密度试验:精密量取对照品溶液,依法测定吸光度,连续测定6次。结果的 RSD为0.145%。
稳定性试验:精密称取供试品1 g,依法制备供试品溶液,每间隔2 h测定1次(n=6)。结果的 RSD为0.549%,表明供试品溶液在12 h内基本稳定。
重复性试验:精密称取同批样品6份,按供试品溶液的制备方法操作。结果多糖平均含量为30.007 mg/g,RSD为0.514%。
加样回收试验:称取已知含量的同一批样品(含量为30.007 mg/g)约1 g,精密称定,加入一定量的对照品,按供试品溶液的制备方法制备溶液,平行试验5次,依法测定含量,计算回收率。结果见表1。
表1 加样回收试验结果
2.5 样品含量测定
取本品粗粉约1 g,精密称定,按拟订方法制备供试品溶液,并依法测定吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液茯神中多糖的浓度,计算,即得。结果见表2。
表2 茯神中多糖含量测定结果
3 讨论
多糖的检测方法一般可分为两大类:一类是直接测定多糖本身,如高效液相色谱法和酶法,但需要有多糖的标样,而且测定结果偏低;另一类是通过显色反应测定吸光度值,即比色法,如水杨酸法、斐林法、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。其中,苯酚-硫酸法由于方法简单、快速,试验成本较低,且无需多糖纯品等优点被广泛采用。此法是先用标准品多糖制作标准曲线后,再通过多糖的显色反应测定吸光度,根据其在曲线上的位置推算出多糖的浓度从而推算其含量。本试验的平均回收率在101.3% ~103.6%之间,精密度试验的 RSD在5%以内,说明以 D-无水葡萄糖为对照品,用苯酚-硫酸法测定茯神中多糖的含量可行。
试验中的苯酚要用蒸馏酚,又称重蒸酚或重苯酚,其纯度高,可用作试验中定量分析试剂,本试验中就是用苯酚重蒸馏后得到的馏分。另外,试验中试剂的加入顺序要正确,先加入待测液,再加入5%苯酚液后,迅速加入浓硫酸,摇匀,待其反应10 min,置40℃的水浴锅中保温15 min,取出后迅速冷却至室温。
多糖作为一类重要的生物活性物质,具有多种药用功能,在抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、愈溃疡等治疗方面已显示出诱人前景。随着多糖药理学及临床学研究的不断深入,含多糖类药物将具有更广阔的开发前景。
[1]江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海人民出版社,1977:1 597.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:附录30.