SMARTer技术构建辣椒黄绿苗突变体叶片全长cDNA文库

马志虎， 孙国胜， 张昌伟， 杨玉霞， 潘跃平

(1.江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400;2.南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)

叶色变异是植物中比较常见的突变类型，一般在苗期表达，但少数突变体直到生育后期才发生叶色突变［1-2］。作物叶色突变体不仅可以作为杂交育种中的形态学标记材料［3］，还在光合作用机制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的发育和遗传控制机理、以及分析鉴定功能基因等研究方面具有重要的利用价值［4-7］。芽黄(Yellow bud mutant)是指幼苗或者植株叶片在前期明显黄化，而后期叶绿素含量逐渐增加，以致黄化叶片完全变成绿色与正常绿色植株无异［8-9］。关于芽黄叶色标记的遗传规律及其实际应用，在番茄、棉花、向日葵、西瓜、黄瓜、玉米等作物上已有报道［1］。目前种子纯度鉴定以田间鉴定为主，缺乏快速有效的方法［10］，芽黄突变体可在苗期作为标记性状剔除杂种，用于提高杂交种纯度，能够简化良种繁育［10］的步骤。

辣椒(Capsicum annuum L.)黄绿苗突变体(Mutant)属基因突变引起的芽黄突变体(Yellow bud mutant)类型，是马志虎等于1997年在由甘肃酒泉引进的辣椒品种96-140牛角辣椒中发现的叶色(幼嫩生长点为黄色)黄绿色隐性突变体材料［11］。利用该突变材料，先后选育辣椒新品种镇椒八号和辣椒黄绿苗胞质雄性不育系。本研究以辣椒黄绿苗突变体幼嫩叶片为材料，采用 Clontech公司的 In-Fusion®SMARTerTMDirectional cDNA Library Construction Kit试剂盒构建辣椒cDNA全长文库，为筛选辣椒叶色突变相关基因和探讨叶色突变分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以辣椒叶色黄绿色隐性突变体 YBM1106—2321作为试验材料(由镇江市农业科学研究所提供，辣椒黄绿苗突变体与本所辣椒材料H2321杂交转育而成，具有幼嫩生长点为黄色，新生平展叶片快速转绿特性的叶片黄绿色隐性突变体新材料)。In-Fusion®SMARTerTMDirectional cDNA Library Construction Kit和 AdvantageTM2 PCR Kit试剂盒购自Clontech公司，CTAB、琼脂糖以及其他常用试剂均购自Generay公司。

1.2 方法

1.2.1 改良CTAB法提取总RNA 采用王艳等［12］的改良CTAB法提取辣椒幼嫩真叶总RNA。

1.2.2 SMARTer技术构建全长cDNA文库 Firststrand cDNA和ds cDNA均采用LD-PCR技术，Firststrand cDNA反应体系如下。SMARTer cDNA合成:在 PCR 管中加入2.00 μl RNA，1.00 μl 3'In-Fusion SMARTer CDS Primer(12 μmol/L)，1.50 μl ddH2O，混匀后72℃反应3 min，42℃反应2 min后，加入事先准备好的如下混合液:2.00 μl 5×First-strand buffer，0.25 μl DTT(100 mmol/L)，1.00 μl dNTP mix(10 mmol/L)，1.00 μl SMARTer V Oligonucleotide(12 μmol/L)，0.25 μl RNase inhibitor，1.00 μl SMARTScribeTMreverse transcriptase(100 U)，共计10.00 μl体系，涡旋混合后短暂离心，42℃保温90 min，然后68℃反应10 min，－20℃保存。

Ds cDNA反应体系:PCR管中加入2.00 μl Firststrand cDNA，80.00 μl ddH2O，10.00 μl 10 × Advantage 2 PCR buffer，2.00 μl 50 × dNTP mix(10 mmol/L)，2.00 μl 5'PCR primer II A(12 μmol/L)，2.00 μl 3'In-fusionSMARTerPCR primer(12 μmol/L)，2.00 μl 50 ×Advantage 2 polymerase mix，反应体系为100.00 μl，2管。将反应物放入95℃预热的PCR仪里按如下参数反应:95℃ 1 min，95℃15 s，65℃30 s，68℃ 6 min。首先反应15个循环，将2个PCR管取出来放在4℃冰箱，其中一管取出25.00 μl，将25.00 μl放入PCR仪按照上述参数每反应3个循环取出5.00 μl，将反应 15、18、21、24、27 个循环的样品进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，确定最佳反应循环数。将剩余的170.00 μl样品平均分成两管，加入10.00 μl 1%的二甲苯青，－20℃保存。

Ds cDNA分级纯化:按照说明书要求，准备CHROMA SPIN+TE-1000柱和16个1.5ml离心管并做好标记，将柱子轻轻摇匀，把柱子下端掰掉，打开上面的盖子，让柱子里的缓冲液自然流出，流速40 ～60 s 1滴，1滴40.00 μl左右，若达不到上述要求则要重新装柱，直到满足条件。待储藏的缓冲液流尽以后，在柱子里加入700.00 μl柱缓冲液，待流干以后，将含有二甲苯青的ds cDNA加到柱子表面，静止片刻，用100.00 μl柱缓冲液洗含有cDNA的管子，等到液体自然流干以后，蓝色的二甲苯青会渗入柱子里面几毫米。向柱子里面加入600.00 μl柱缓冲液，开始收集流份，每个离心管1滴。每管取3.00 μl进行1.1%琼脂糖凝胶电泳，将最先出现条带的4～5部分合并。向合并的样品中加入1/10体积的醋酸钠(3 mol/L;pH 4.8)，1.30 μl糖原，2.5倍体积－20℃预冷的95%乙醇，混匀后－20℃过夜，然后室温14 000 r/min离心20 min，去掉上清液后，加入600.00 μl 80%的乙醇，室温14 000 r/min离心5 min，去上清液，室温干燥10 min后用10.00 μl ddH2O溶解沉淀。

连接载体:连接反应按照说明书上的要求，共做3 个反应(表1)，每个反应10.00 μl，50 ℃连接15 min后迅速置于冰上。每管反应液中加入90.00 μl TE和10.00 μl QuickClean松脂，涡旋1 min后离心一下，吸取上清液，加入1.20 μl糖原，混匀后加入280.00 μl 100%乙醇，前后摇晃混匀，－70℃沉淀过夜。然后15 000 r/min室温离心20 min，小心去除上层乙醇，室温干燥后，加入10.00 μl DEPC水溶解沉淀。

表1 cDNA与载体连接梯度体系Table 1 Reaction systems for ligating cDNA into vector

重组质粒的转化:在预冷的1 cm的电转杯中加入25.00 μl大肠杆菌感受态细胞 Electro-cells DH5α 和10.00 μl连接产物，1 500 V 电压下脉冲5.2 ms。电转产物子225 r/min、37℃培养1 h后取2.00 μl均匀涂抹到含有 100 μg/ml氨苄青霉素、1 mmol/L IPTG、75 μg/ml X-Gal的 LB 培养基上，37℃培养过夜，剩余的转化产物4℃下保存。

文库质量的检测:从培养过夜的平板中挑取24个白斑单克隆，分别培养在含有100 μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、225 r/min培养4 h，取菌液进行PCR检测。体系如下:14.40 μl ddH2O，0.40 μl Forward screening primer(10 μmol/L)，0.40 μl Reverse screening primer(10 μmol/L)，1.60 μl dNTP(10 mmol/L)，2.00 μl 10 × PCR buffer，1.00 μl菌液，0.20 μl Taq 聚合酶，共 20.00 μl。反应条件为:94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共30个循环，72℃ 10 min，反应结束后取5.00 μl PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

文库滴度的测定:取10.00 μl文库，加入1 ml LB培养基，取10.00 μl稀释100倍的文库，加入1 ml LB培养基。然后取10.00 μl稀释100倍的文库加入50.00 μl LB 培养基后涂板，取稀释 50.00 μl稀释10 000倍的文库涂板，培养过夜后计算文库滴度。

2 结果

2.1 辣椒叶片总RNA提取

提取RNA以后，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果(图1)显示:28S和18S条带亮度大约2∶1，说明RNA质量比较好。OD260/OD280值为1.98，说明RNA纯度较高，没有杂质污染，浓度为1 815.2 μg/ml，可以用于后续试验。

图1 辣椒叶片总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose electrophoretogram of total RNA from the leaves of Capsicum annuum L.

2.2 辣椒叶片First-strand cDNA和ds cDNA合成

合成First-strand cDNA和 ds cDNA后，将15、18、21、24和27个循环后的ds cDNA进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图2)显示:15、18个循环的条带亮度很低，21个循环的条带分布在2 000 bp左右，24和27个循环的产物片段过长，表明21个循环后的cDNA比较合适，符合文库构建要求。

图2 辣椒叶片双链cDNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose electrophoretogram of double strand cDNA from the leaves of Capsicum annuum L.

2.3 辣椒叶片cDNA的分级纯化

过完柱子的cDNA进行1.1%琼脂糖凝胶电泳，结果(图3)显示:cDNA从第6管开始出现，故合并6～9个流份进行连接，将剩余的cDNA舍去。

图3 过完柱子的辣椒叶片cDNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Agarose electrophoretogram of double strand cDNA from the leaves of Capsicum annuum L.after size fractionation

2.4 辣椒cDNA文库质量鉴定

将3个连接反应的产物与载体连接后涂板，根据说明书要求测定各反应的滴度，结果显示，Ds cDNA反应体系的连接效果最好，滴度为1.76×106PFU/ml，cDNA 与载体比例为2.25∶1.00。挑取 24个单克隆进行PCR扩增后，结果(图4)显示:片段大小在500～2 000 bp之间，平均长度为1 170 bp，重组率为94%。

图4 辣椒叶片cDNA文库片段PCR检测Fig.4 PCR detection of cDNA library from the leaves of Capsicum annuum L.

3 讨论

Clontech公司的 SMART(Switching mechanism at 5'end of RNA template)技术是现在广泛应用的cDNA文库构建策略［13-14］，本文应用最新的SMARTer技术进行cDNA文库构建，其优点是所需材料少，50 ng RNA就可以满足试验要求，方便快捷，效率高。SMARTer技术通过用SMARTer V Oligo对5'端加上特定的接头序列，引物在5'端与接头结合就能合成全长cDNA，大大提高了试验效率。此外，第一链和第二链cDNA合成都采用LD-PCR技术，起始RNA用量少，50 ng就能满足建库要求。本试验中，采用改良CTAB法提取RNA，克服辣椒叶片多糖、次生物质多［15］对RNA提取的影响，能够提取到高纯度、高完整性、高浓度的RNA，满足文库构建的要求。文库构建是在RNA水平上进行的，避免了纯化mRNA的步骤，能够避免纯化过程中RNA的降解以及mRNA的损耗，保证cDNA合成时能够获得全长cDNA。

SMARTer技术在cDNA与载体连接时，不需要进行酶切，可以直接与载体pSMART2IFD连接，避免在酶切回收时对cDNA的损失，大大提高了连接效率。设计3个连接反应，能够找到合适的片段与载体的比例。文库构建完成以后对文库质量的评估是通过文库滴度、插入片段的大小以及重组率来进行［16］。本试验构建的辣椒叶片cDNA文库的滴度为1.76 ×106PFU/ml，插入片段平均为1 170 bp，重组率94%，比较理想，能够满足后期试验对目的基因筛选的要求。

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