时间分辨荧光免疫分析法在乙型肝炎病毒表面抗原检测中的应用

王雄

(陵水黎族自治县妇幼保健院检验科，海南陵水572400)

时间分辨荧光免疫分析法在乙型肝炎病毒表面抗原检测中的应用

王雄

(陵水黎族自治县妇幼保健院检验科，海南陵水572400)

目的探讨时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)定量检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的临床应用价值。方法分别用TRFIA和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测237例血清样本HBsAg，并在高、中、低三浓度中各取20例标本用两种方法复检，对比结果进行分析。结果在237例标本中，TRFIA测得阳性99例，ELISA阳性91例，阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)；高、中浓度标本各20例均为阳性，检出率差异无统计学意义(P＞0.05)，而低浓度标本中用TRFIA测得阳性20例，ELISA只有12例阳性，检出率差异有统计意义(P＜0.01)。结论TRFIA较敏感，在低浓度HBsAg检测中更具优势，提高了临床检测水平，具有较高的实用价值。

时间分辨荧光免疫分析法；酶联免疫吸附试验；乙型肝炎表面抗原；定量检测

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所导致的一种在全球广泛流行的传染病，以HBV感染数和HBsAg携带率估算，全世界HBsAg携带者有3.5亿人，其中亚、非、拉地区有2.8亿，据中国流行病学调查，乙肝人群发生率较高，HBsAg携带率约为15%[1]，占全世界HBsAg携带者的1/3，而HBsAg的检出是乙型肝炎的早期诊断之一，因此需要一种准确、灵敏、简便的检测方法。随着科学技术的不断发展，其检测的方法越来越多，各具特点。国内分为定性和定量检测，抗原定性实验一般是用酶联免疫吸附实验(ELISA)，该法使用双抗体夹心法，具有易操作、重复性好、试剂稳定等优点；定量分析则有各种化学发光法和放射免疫分析法，这些方法因仪器、试剂昂贵或使用放射性元素而无法普及应用。最新发展起来的采用非放射免疫标记技术的时间分辨荧光免疫测定分析法(TRFIA)，用镧系元素标记抗原或抗体，同时利用时间和波长两种技术有效排除干扰，具有酶标记、同位素标记技术的优点，且不受样品的自然荧光干扰，灵敏度高、特异性强、重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、易于自动化和应用范围广泛等优点，近年来得到极大发展[2-3]。为了加强对乙型肝炎潜伏期的检测，本文采用ELISA法与TRFIA法检测237例标本血清，探讨其在检测HBsAg中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 标本来源随机抽取来自本院门诊健康体检和孕产妇的乙肝测定血液标本237例，同时用TRFIA和ELISA分别作定量和定性测定，其中男性126例，女性111例，年龄10～70岁，平均(46.47±15.69)岁。

1.2 试剂ELISA法使用北京万泰生物技术有限公司提供的乙肝病毒表面抗原诊断试剂盒，TRFIA法使用中山达安基因股份有限公司提供的乙肝病毒表面抗原定量检测试剂盒。

1.3 仪器中山达安基因股份有限公司生产的DR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪，芬兰进口Thermo-MK3酶标仪等。

1.4 方法将分离到的标本血清分别用TRFIA法和ELISA法进行检测。TRFIA法定量检测乙型肝炎HBsAg的含量；ELISA法定性检测HBsAg，结果判为阴性和阳性。实验操作严格按照试剂盒说明书进行，同时加入相应的标准质控进行检测。先用两种方法检测收集的标本血清HBsAg阴阳例数，当ELISA法测得S/COS＞1，TRFIA法＞0.5 ng/ml时，HBsAg结果为阳性；反之，结果为阴性。然后，将TRFIA法测得的HBsAg定量结果按＞225 ng/ml，5～225 ng/ml，＜5 ng/ml为标准分为高、中、低三个浓度，并各取20份再用两种方法进行检测。

1.5 统计学方法采用SPSS13.0软件进行统计学处理，数据用配对资料的χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法测定237例临床血清标本结果在237例标本中，TRFIA法测得结果阳性99例(42%)，ELISA法测得结果91例(38%)，两种方法检测结果阳性有91例，TRFIA法阳性而ELISA法阴性的有8例，利用配对资料的χ2检验，差异无统计意义(χ2=0.56，P＞0.05)，两法检测结果符合率为96.62%。

2.2 两种方法检测高、中、低三种浓度血清HBsAg结果的比较将上述HBsAg含量高浓度血清(TRFIA法检测结果＞225 ng/mL)，HBsAg含量中等浓度血清(TRFIA法检测结果在5～225 ng/ml之间)，HBsAg含量低浓度血清(TRFIA法检测结果＜5 ng/ml)各取20例分别用两种方法进行测定，结果见表2。可以发现，HBsAg含量高浓度和中浓度的血清用两种方法均可检测出来，符合率为100%，高浓度和中浓度的两种检测方法间差异无统计学意义(P＞0.05)。但在HBsAg含量低浓度的血清中，由于接近ELISA的最低检出浓度，只有60%的阳性检出率，有8例血清标本处于标本对临界值(S/CO)以下而漏检。采用配对资料的χ2检验，两法的检出率差异有统计学意义(χ2=10，P＜0.01)，见表1。

3 讨论

表1 两种方法检测高、中、低三种浓度血清HBsAg结果的比较(n=60)

国内目前定性检测乙肝HBsAg最常用的方法是酶联免疫吸附实验(ELISA)。ELISA属于初筛实验方法，该法简单、方便、快速、成本低，敏感性可达0.7 ng/ml[4]，测定下限进口试剂盒可达0.2 ng/ml，国产试剂盒为0.5～2 ng/ml[5]，使用定性方法检测HBsAg仅能对结果进行阴、阳性的判断，这已无法满足临床的要求。在本实验表1中两种方法检测的结果符合率为96.62%，说明了两种方法检查结果具有很高的一致性，但仍有少部分结果不符，这可能是ELISA法在操作中的影响因素较多，比如溶血、红细胞等外源性物质，自身抗体、补体和易发生交叉反应的内源性物质以及手工加样、洗板等操作因素都易引起实验结果的假阳性；而抗体的包被质量及反应温度、时间、钩状效应等都易引起实验结果的假阴性，另外ELISA法不能用于定量检测，这局限了ELISA的应用。在本实验中，用两种方法检测标本HBsAg浓度旨在探讨比较ELISA和TRFIA检测该指标的敏感性，ELISA法检测的20例高、中浓度标本均无漏检，但在低浓度血清标本HBsAg＜5 ng/ml的检测中，有8例假阴性，阳性率仅为60%，说明TRFIA的敏感性要高于ELISA，在实际工作使用TRFIA法可避免因外源性或内源性因素引起的漏检和错诊。

时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)因使用镧系元素作为标记物，有效排除背景荧光的干扰，提高了TRFIA法的灵敏度。而且时间分辨荧光免疫分析技术属全自动检测仪，能提供稳定、均一、可靠的试验条件，避免由人为因素所引起的加样误差。与ELISA相比，用TRFIA定量测定乙肝病毒血清标志物给了临床一个量化指标，能准确及时敏感地反映患者体内病毒标志物的含量，使结果更加直观。近年来应用荧光定量PCR法检测HBV DNA由于波动频率和幅度较大，单独使用很难精确识别非活动性HBV携带者，HBsAg定量与HBV DNA定量形成了信息互补，HBsAg定量可以作为病毒感染的标志，而HBV DNA定量则可以作为病毒复制的指标，两种方法联合应用可以识别非活动性HBV携带者。TRFIA对于HBsAg的检测灵敏度0.05 ng/ml以下[6]，能对低水平存在的HBsAg进行有效检测。在慢性肝炎(CHB)中HBV感染的自然史一般可分为4个期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低(非)复制期和HBeAg阴性肝炎期，其中在非活动期时HBsAg水平最低，使用TRFIA方法对HBsAg定量检测可以用于准确判断CHB所处的阶段，具有重要的临床意义。

综上所述，TRFIA的敏感性要高于ELISA，在实际工作可避免引漏检和错诊。而且HBsAg定量不仅可以反应慢性HBV感染史，便于观察HBV感染动态和检测低水平的HBV感染指标，尤其还可以对抗病毒治疗应答情况进行预测。目前时间分辨免疫荧光分析仪只适用于成批检测，不适于单份样本操作，而且操作时间相对较长，仍有一定的缺陷，但是随着检验技术的不断进步，HBsAg定量检测必将在临床应用中发挥越来越大的作用。

[1]秦望森.两种检测乙肝血清学标志物方法的临床对比[J].中国老年杂志,2011,31(7):226.

[2]Diamandis EP.Time-resolved fluorometry in nucleic acid hyBfidization and wtem Blotting techniques[J].Eleetrophoresis,1993,14(9): 866-875.

[3]潘丽,李玲艳,李胡焕,等.时间分辨与酶联免疫检测乙型肝炎表面抗体的结果分析[J].实用医技杂志,2011,18(10):1064-1065.

[4]陈佑明,黄敬,刘京平.两种方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的比较[J].检验医学与临床,2009,6(7):495-496.

[5]刘荣静,习浩,林列坤.乙型肝炎病毒表面抗原弱反应性标本的检测及临床意义[J].检验医学与临床,2010,7(5):404-405.

[6]蔡军,刘晓丽.时间分辨荧光免疫分析法测定乙肝HBsAg的临床意义[J].山西医科大学学报,2011,42(5):406-407.

Clinical application of time-resolved fluoroimmunoassay for detecting hepatitis B virus surface antigen.

WANG Xiong.Department of Clinical Laboratory,Lingshui County Maternal and Child Health Hospital,Lingshui 572400, Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical application of time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA) in quantitative measurement of hepatitis B virus surface antigen.MethodsQuantitative and qualitative analysis of 237 serum samples were detected by TRFIA and ELISA,respectively.Twenty samples of high,medium and low concentration of HBsAg were taken respectively for redetermination by the two methods.ResultsOf the 237 samples, 99 were positive for HBsAg with TRFIA assay,and 91 were positive for HBsAg with ELISA assay.There was no statistically significant difference between the two methods(P＞0.05).The 20 samples of high or medium concentration of HBsAg were all positive by both TRFIA and ELISA,with no statistically significant difference between two methods(P＞0.05).However,the detection rate with TRFIA assay was significantly higher than that with ELISA assay in the 20 samples of low concentration(P＜0.01).ConclusionTRFIA assay is more sensitive in quantitative detection of hepatitis B virus surface antigen.Moreover,TRFIA assay has more advantages than ELISA in detection of low concentration samples.We believe that TRFIAhas a higher application value.

Time-resolved fluorimmunoassay(TRFIA);Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA); HBsAg;Quantitative detection

R512.6+2

A

1003—6350（2013）18—2693—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.18.1121

2013-03-21)

王雄。E-mail：www3630@163.com