白血病细胞中NF-κB的活化状态及其对细胞凋亡的影响

冯金，刘小勇

（柳州市柳铁中心医院检验科，广西柳州545007）

白血病细胞中NF-κB的活化状态及其对细胞凋亡的影响

冯金，刘小勇

（柳州市柳铁中心医院检验科，广西柳州545007）

目的探讨白血病细胞株中核转录因子NF-κB的活化状态及其对白血病细胞凋亡的影响。方法流式细胞术检测白血病细胞及对照组细胞PBMC凋亡率；双荧光素酶报告基因检测各组细胞NF-κB相对活性；NF-κB抑制剂PDTC作用12 h后检测各组白血病细胞NF-κB相对活性及细胞凋亡率的变化。此外，qPCR及Western Blot分别检测各组细胞凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的mRNA及蛋白水平的改变。结果与PBMC比较，各组白血病细胞凋亡率明显下降(P＜0.05)；双荧光素酶报告基因结果显示各组白血病细胞的NF-κ B活性显著高于PBMC(P＜0.05)；PDTC作用后各组白血病细胞NF-κB活性明显下降，细胞凋亡率明显升高(P＜0.05)；同时，各组白血病细胞Bax的mRNA及蛋白表达水平均明显增高(P＜0.05)，而Bcl-2的表达水平明显降低(P＜0.05)。结论白血病细胞中存在NF-κB的持续性激活，其激活可导致白血病细胞凋亡受阻。

白血病；NF-κB；细胞凋亡

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，是国内十大高发恶性肿瘤之一，也是儿童和青少年发病率和病死率最高的恶性肿瘤。改善这一类疾病的疗效将极大提高人们的生活质量。然而，临床上白血病的化疗常常出现耐药，其可能与白血病细胞凋亡受阻有关[1]。多种实体肿瘤研究表明，核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)持续升高导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐受，是肿瘤耐药的重要原因[2]。NF-κB是一类能与多种基因启动子或增强子κB位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质。在正常造血细胞中，NF-κB信号通路通常处于非活化或低活化状态[3]。有研究发现，白血病细胞中有高表达的NF-κB[4]。那么，高表达的NF-κB是否介导了白血病细胞的凋亡受阻？为此，本课题通过检测NF-κB在白血病细胞中的活化状态，探讨其对白血病细胞凋亡的影响，以期为白血病的治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 细胞系及质粒人慢性髓性白血病急变K562细胞、人急性单核白血病THP-1细胞和急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞均购自上海生命科学院细胞库，本室常规保存。取正常人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)为对照。海肾荧光素酶表达载体pRL-TK质粒购自Promega公司；pNFκB-TA-luc质粒购自碧云天生物科技研究所。

1.2 试剂胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基购于美国Gibco公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自上海Sangon生物工程公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒为中国凯基生物制品；xfectTM转染试剂购于美国clontech公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒购自Promega公司；TRIzol、qPCR试剂盒购自Takara公司；小鼠抗人Bax、Bcl-2单抗购于美国bioworld公司；羊抗小鼠IgG抗体购于北京中杉金桥公司；比格烷二硫代氨基甲酸盐(Pyrrolidine dithiocarbam-ate，PDTC)购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养K562、THP-1和HL-60细胞均用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/m1)、链霉素(100 U/m1)的RPMI 1640培养液，培养于含5%CO2的37°C恒温培养箱中，取对数生长期的细胞进行实验。采用Ficoll密度梯度离心法分离出PBMC为对照。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡收集对数生长期各组细胞(1～5)×105个，PBS洗涤3次后，重悬于500 μl反应缓冲液中。于上述缓冲液中加入5 μl Annexin V-FITC并充分混匀；再加入5 μl PI染液，混匀；室温避光反应5～15 min，立即上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复三次。

1.3.3 双荧光素酶报告基因检测细胞NF-κB活性将对数生长期各组细胞(8×105)接种于6孔板中，采用xfectTM转染试剂将5 μg pNFκB-TA-luc质粒及0.5 μg pRL-TK Vector(转染效率内参)共转染各组细胞，培养于含5%CO2的37℃恒温培养箱中。转染第48 h检测各组荧光素酶的活性。根据Promega试剂盒Dual-Luciferase Reporter Assay System技术手册进行操作，以pRL-TK为内参，通过Turner TD20/20 luminometer检测仪检测荧光强度。以虫荧光素酶活性(pNFκB-TA-luc)和海肾荧光素酶活性(pRL-TK)的比值(FL/RL)来表示NF-κB相对活性。实验重复三次。

1.3.4 qPCR检测各组细胞Bax及Bcl-2的mRNA水平收集各组细胞，Trizol抽提总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR检测。以人β-actin为内参，qPCR法检测各组细胞Bax及Bcl-2 mRNA的表达。反应引物序列见表1。qPCR扩增条件为：95℃预变性30 s后，94℃10 s，55℃20 s，72°C 30 s，循环35次。循环结束后进行融解曲线分析。用2-△△CT值表示基因的相对表达量。实验重复三次。

表1 PCR反应引物序列

1.3.5 Western blot检测Bax及Bcl-2蛋白的表达收集对数生长期各组细胞，提取细胞总蛋白，Bradford法测蛋白浓度。取80 μg细胞蛋白提取液，用12%的分离胶分离蛋白质，湿转转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭3 h，分别与兔抗人Bax及Bcl-2单克隆抗体(1:500稀释)4℃孵育过夜后，与二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，l:1 000稀释)孵育1 h，洗涤后用化学发光进行显色。实验重复三次。

2 结果

2.1 流式检测细胞凋亡率流式检测K562、 THP-1、HL-60细胞及PBMC细胞凋亡率，结果发现，三组白血病细胞的凋亡率分别为(2.15±0.35)%、(1.82± 0.42)%、(1.15±0.37)%，明显低于与对照组细胞凋亡率的(5.78±0.39)%，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 流式细胞术检测白血病细胞的凋亡率

2.2 双荧光素酶报告基因检测细胞NF-κB活性荧光素酶报告基因检测K562、THP-1、HL-60细胞及PBMC细胞NF-κB相对活性的改变。，各组白血病细NF-κB活性分别为(1.54±0.45)、(1.62±0.37)、(1.49±0.55)，显著高于对照组细胞，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

图2 荧光素酶报告基因检测白血病细胞NF-κB的相对活性

2.3 PDTC作用后白血病细胞NF-κB活性的改变用100 μmol/L的PDTC处理各组白血病细胞后12 h后双荧光素酶报告基因检测细胞NF-κB活性的改变，结果发现，PDTC作用后各组细胞的NF-κB活性均显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

2.4 PDTC作用后的白血病细胞凋亡率的改变PDTC抑制白血病的NF-κB活性后是否影响各组细胞的凋亡？流式检测PDTC处理12 h后白血病细胞凋亡率的改变，结果发现，各组细胞的凋亡率较抑制剂处理前显著增高(P＜0.05)，见表2。

图3 PDTC处理后白血病细胞NF-κB的相对活性

表2 PDTC处理白血病细胞凋亡率的改变

表2 PDTC处理白血病细胞凋亡率的改变

注：aP＜0.05，无PDTC处理组细胞与PDTC处理组细胞比较。

组别PDTC(-)PDTC(+) Bax Bcl-2 β-actin 2.15±0.35 1.82±0.42 1.15±0.37 6.23±0.73a4.18±0.27a4.55±0.31a

2.5 PDTC作用后白血病细胞及Bcl-2的mRNA水平的改变qPCR检测PDTC作用前后各组白血病细胞Bax及Bcl-2 mRNA表达水平的改变。结果显示：PDTC作用后，各组白血病细胞的Bax mRNA水平较药物作用前均显著增高，Bcl-2的表达在药物作用后均明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图4。

图4 PDTC作用后白血病细胞Bax、Bcl-2 mRNA表达水平的改变

2.6 PDTC作用后白血病细胞Bax及Bcl-2蛋白表达的改变Western blot进一步检测各组白血病细胞在PDTC作用后Bax及Bcl-2蛋白水平的改变。与为未处理组比较，PDTC作用后，各组白细胞Bax的蛋白水平均显著增高，而Bcl-2表达水平明显降低，差异具有统计学意义，见图5。

图5 PDTC作用后白血病细胞Bax、Bcl-2蛋白表达水平的改变

3 讨论

肿瘤细胞抵抗凋亡往往导致化疗耐受[5]。探究这一类患者化疗耐受的机制将极大提高该类人群的治疗效果及生活质量。已知NF-κB的持续性活化是导致多种肿瘤耐药的主要原因[6]。本研究检测了NF-κB在各类型白血病细胞中的表达状态，并探讨其表达对白血病细胞凋亡的影响，从而白血病的治疗提供可能的策略。

实验中我们选取人慢性髓性白血病急变K562细胞、人急性单核白血病THP-1细胞和急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞为研究对象，同时选取PBMC为对照，检测各组细胞凋亡水平。结果发现，与对照组相比，各组白血病细胞明显降低。我们进一步检测各组细胞NF-κB转录活性的表达。结果显示，各组白血病细胞的NF-κB转录活性较对照组明显升高，提示白血病中持续性高表达的NF-κB可能是导致白血病细胞抵抗凋亡的原因之一。

为进一步证实白血病细胞中活化的NF-κB导致细胞抵抗凋亡，将NF-κB信号的抑制剂PDTC处理各组白血病细胞。PDTC是一种具有抗氧化剂作用的、有效的NF-κB抑制剂[7]。本研究中，PDTC作用12 h后，各组白血病细胞的NF-κB活性明显下降。进一步检测各组细胞凋亡率，结果发现，各组白血病细胞凋亡在PDTC处理后明显增高。此外，我们还检测各组细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平的改变。结果显示，PDTC处理后白血病细胞Bax的mRNA及蛋白表达水平均明显升高，而Bcl-2的表达水平明显下降。以上结果进一步证实NF-κB活化抵抗了白血病细胞凋亡。

总之，在白血病中存在NF-κB的异常激活，其通过抵抗细胞凋亡而导致临床上对白血病的治疗预后差，这为临床白血病的治疗提供新的靶点。此外，本研究中的PDTC可下调NF-κB信号通路的活性，并诱导细胞凋亡，提示PDTC可能是治疗白血病的一个有效途径，有必要进一步的研究与开发。

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Activation condition of NF-κB in leukemia cells and its effect on cellular apoptosis

FENG Jin,LIU Xiao-yong. Department of Laboratory Medicine,Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital,Liuzhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the activation condition of NF-κB in leukemia cells and its effect on cellular apoptosis.MethodsFlow cytometry was used to detect the apoptosis of leukemia cells and peripheral blood mononuclear cell(PBMCs).The relative activities of NF-κB in the cells were assessed by luciferase reporter assays. After treated by PDTC(the inhibitor of NF-κB)for 12 h,the activation condition of NF-κB and apoptosis in leukemia cells were analyzed.In addition,the mRNA and protein expression of Bax and Bcl-2 were analyzed by qPCR and Western blot,respectively.ResultsCompared with PBMCs,cellular apoptosis in leukemia cells were significantly decreased(P＜0.05).The results of luciferase reporter showed that the relative activities of NF-κB were tly higher in leukemia cells than PBMCs(P＜0.05).Upon PDTC treatment for 12 h,the relative activities of NF-κB in leukemia cells were significantly decreased,while cellular apoptosis were significantly increased(P＜0.05).Additionally,the mRNA and protein expression of Bax in leukemia cells were significantly increased(P＜0.05),while the mRNA and protein expression of Bcl-2 were remarkably decreased(P＜0.05).ConclusionConstitutively activated NF-κB exists in the leukemia cells,and it's constitutively activation induces cellular apoptosis resistance.

Leukemia;NF-κB;Apoptosis

R733.7

A

1003—6350（2013）06—0785—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.06.0337

2012-10-30)