脂蛋白磷脂酶A2 基因V279F 和A379V 多态性与老年冠心病的关系

赵娜娜 洪梅 鲁翔 严腊梅 周海波 贾志强

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病(coronary heart disease，CHD)，是目前严重危害老年人生命健康的最常见心血管疾病，研究证实炎症在冠状动脉硬化发生和发展过程中起着重要作用，多种炎症因子被证实参与了动脉粥样硬化的形成和发展［1-2］。脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)作为一种新型炎症因子，与CHD 的发生密切相关。研究报道表明Lp-PLA2 的V279F、A379V、R92H和I198T 基因的多态性与CHD 的遗传易感性具有相关性［3］，但是对于V279F 和A379V 基因多态性对CHD 的研究结论尚不一致，而且针对老年患者的研究较少见［4］，本文利用DNA 测序方法对中国老年汉族人群Lp-PLA2 基因多态性分布与CHD 遗传易感性的相关性进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2011 年2 月至2012 年3 月期间在我院心内科住院的老年CHD 患者227 例，其中男119例，女108 例，年龄60 ～89 岁，平均(71.66 ±7.05)岁。对照组来源于本院健康体检者101 例，其中男36例，女65 例，年龄60 ～88 岁，平均(66.94 ±6.57)岁。所有入组人员年龄≥60 岁，均行冠状动脉造影检查，CHD 的诊断符合WHO 的诊断标准。以左前降支、左回旋支和右冠状动脉及其主要分支中至少有1 支冠状动脉狭窄≥50%为有意义病变，或者患者有明确心肌梗死病史。所有患者均除外肿瘤、血液系统疾病、慢性肝肾功能不全等系统性疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 监测指标:记录患者既往疾病史及吸烟史。空腹12 h 取静脉血2 ml，用德国ROCHE 公司P800 全自动生化分析仪检测三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等生物化学指标。

1.2.2 外周血白细胞DNA 的制备:取EDTA 抗凝的静脉血200 μl，用美国Invitrogen 公司提供的基因组DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，TE 溶解保存于－20 ℃冰箱中。

1.2.3 Lp-PLA2 基因V279F 和A379V 位点的基因型检测:Platinum®Taq DNA 聚合酶，定制引物均由美国Invitrogen 公司提供，V279F 引物序列包括上游引物:5'-TCCAGTGTGGGTGACTACAAA-3'，下游引物 5'-TATGGGGGCAAAAGAATAGC-3';A379V 引物序列包括上游引物:5'-TCAAGATACCAAGCAAGAACAAGA-3'，下游引物5'-GGATGTAAAGCAGCAAAATTGA-3'。待测样品PCR 完毕，1.5% 的琼脂糖胶鉴定，使用3730XL 型DNA 测序仪进行测序。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0 统计软件，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t 检验;计数资料以百分数表示，组间比较采用卡方检验。检验水准为α=0.05，P ＜0.05 表示差异具有统计学意义。采用SHEsis 软件分析2 组的Hardy-Weinberg 平衡，组间基因型和等位基因频率用Fisher's 精确概率检验。同时应用非条件logistic 逐步回归模型分析CHD 主要危险因素，以比值比(OR)及其95%可信区间(95%CI)表示相对危险度。

2 结果

2.1 一般资料比较 CHD 组与对照组在高血压、TG 水平等方面的比较无统计学差异，而CHD 组的年龄、吸烟比例和糖尿病比例明显高于对照组(P ＜0.05)，血清TC、HDL-C 及LDL-C 水平则明显低于对照组(P ＜0.05)。见表1。

表1 2 组基本资料比较

2.2 V279F 和A379V 基因型分布和等位基因频率的比较 V279F 有VV 型、VF 型和FF 型3 种基因型，A379V 包括AA 型、AV 型和VV 型3 种基因型。CHD组与对照组之间V279F 和A379V 基因型的分布及等位基因频率:V279F 和A379V 在CHD 组和对照组之间的分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)，V279F和A379V 基因型和等位基因的频率在CHD 组和对照组之间分布差异均无统计学意义。CHD 组的亚组分析:V279F 和A379V 的基因型和等位基因的频率在心肌梗死组和非心肌梗死组的分布无统计学差异。见表2，3。

表2 V279F 基因型的分布及等位基因频率(n，%)

表3 A379V 基因型的分布及等位基因频率(n，%)

2.3 单倍型分析 单倍型分析显示FA、FV、VA、VV 4 种单倍型在CHD 组和对照组分布差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表4。

表4 V279F 和A379V 的单倍型分析

2.4 CHD 主要危险因素的logistic 回归分析 以是否为CHD 作为因变量，年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病、TG、V279F、A379V 为自变量，进行logistic 回归分析，在校正传统风险因素后，未发现V279F 和A379V变异使患者患CHD 的风险增加。

3 讨论

Lp-PLA2 又称为血小板活化因子乙酰水解酶，是磷脂酶超家族中的一员，主要由单核巨噬细胞和淋巴细胞合成分泌，以多种亚型分布于细胞内和细胞外，Lp-PLA2 属于非钙离子依赖型，能够催化甘油磷脂第2 位酰基酯键水解，在血液循环中主要与脂蛋白颗粒结合存在，绝大部分与低密度脂蛋白结合，少量与高密度脂蛋白及极低密度脂蛋白结合［5-6］。研究证实Lp-PLA2 的促动脉粥样硬化的作用通过多种细胞途径完成，与CHD 的发生发展密切相关，被认为是独立于传统心血管危险因素的独立危险因子［7-8］。Guerra 等［9］研究表明LP-PLA2 活性62%受遗传因素的影响，编码Lp-PLA2 的基因位于第6 号染色体p21.2-p12，包含12个外显子。在Lp-PLA2 基因多态性与CHD 相关性研究方面，日本研究者首先报道了9 号外显子上V279F的变异对Lp-PLA2 活性的影响，该位点的错义突变使缬氨酸变为苯丙氨酸，杂合突变可使酶活性下降，少数的纯合突变甚至使酶失去活性，增加了日本人口心肌梗死和脑卒中的风险，可能是动脉粥样硬化的遗传因素之一［10］。Liu 等［11］对台湾人群的研究发现V279F变异与CHD 心肌梗死的风险无明显相关性，Hou等［12］对中国汉族人群的研究同样未发现V279F 变异能够增加CHD 的发病风险，而韩国的研究发现V279F变异可降低CHD 的发病风险［13］。随后Li 等［14］的研究却发现中国汉族人群的V279F 的突变与CHD 是具有相关性的，之后更多研究发现V279F 变异只存在于亚洲人种，并未在高加索人中发现，而且研究结果尚有矛盾，结论不一。此外，早期的Kruse 等［15］研究表明了11 号外显子上A379V 的变异降低了Lp-PLA2 与底物亲和力，在高加索人过敏症和哮喘的发生中可能起着关键作用。而后Ninio 等［16］研究发现CHD 组A379V 的379V 等位基因的频率明显低于对照组，提出379V 等位基因携带者对心血管有保护作用，可能降低CHD 的发病风险。Li 等［14］的研究也同时指出该A379V 基因突变增加了心肌梗死的风险。杜克大学医学中心研究［4］指出A379V 的突变，可导致Lp-PLA2与底物亲和力的降低，与CHD 具有相关性。

本研究发现在汉族老年人口中，CHD 组V279F 和A379V 的基因型和等位基因频率与对照组无明显差异，心肌梗死组与非心肌梗死组间亦无统计学差异。进一步进行单体型分析未能发现与CHD 发病相关的单体型。在校正传统危险因素后进行的logistic 回归分析也未能发现与CHD 相关的基因型和等位基因。在本研究中出现了CHD 组的血清TC、HDL-C 以及LDL-C 水平明显低于对照组的情况，考虑由于绝大多数CHD 患者在入院前已经服用调脂药物治疗，导致血脂水平降低。由于本研究总体样本量较少，在进行入组筛选时将左前降支、左回旋支和右冠状动脉及其主要分支中至少有一支冠状动脉狭窄≥50%纳入CHD组，而对照组中尚存在一部分有冠脉粥样硬化病变的患者，从而可能轻度导致V279F 和A379V 的基因型和等位基因频率与CHD 组无明显差异，在加大样本量以及分组标准更加细致化的时候可能会避免上述问题，使最后结果更有意义。

总之，对中国老年汉族人群的Lp-PLA2 基因多态性的研究，与国内的一些研究结果基本一致，但由于实验条件所限未能定量定性检测Lp-PLA2 的活性，未能更加明了直观地分析V279F 和A379V 多态性与Lp-PLA2 活性的关系。随着Lp-PLA2 基因多态性研究的不断完善和深入，Lp-PLA2 多态性位点的检测与老年CHD 的关系将会更加明确。

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