2－脱氧葡萄糖联合顺铂对胰腺癌细胞系的体外抑制作用

西安交通大学医学院第一附属医院 （西安710061） 穆 喆 耿希刚

由于胰腺癌早期症状不明显，待出现症状多已为中晚期，失去最佳治疗机会，且胰腺位置毗邻重要脏器，给手术和放疗造成了很大的困难。至今，胰腺癌的治疗效果并不令人满意，5年生存率仅仅从20世纪70年代的3%上升至4%［1］。对胰腺癌，尤其是晚期的胰腺癌，虽然主要采用吉西他滨等化疗方案，由于其毒副作用等的限制，未能有很好的综合效果，分子靶向药物的疗效也有待进一步提高，因而胰腺癌的治疗方案，仍需要进一步的探讨，可能的治疗思路，来自对胰腺癌细胞的高度依赖的糖酵解途径（Wer ber g效应）［2］进行拦截。1962年，Br own［3］报道了2－脱氧葡萄糖（2－Deoxyglucose，2－DG）对肿瘤有抑制作用后，2－DG 作为抗肿瘤药物引起了人们的关注。2－DG和葡萄糖具有相似的结构，被肿瘤细胞摄取后，能够和细胞内的己糖激酶［4－5］结合，竞争性抑制己糖激酶的活性，阻碍糖酵解的进一步进行，干扰肿瘤细胞ATP的合成，从而阻断肿瘤细胞的能量来源［6－7］，造成细胞内ATP剥夺，使得细胞死亡。随着更深入的研究，人们发现2－DG对肿瘤细胞还有其他的作用机制，如对糖基化的抑制［8］，对凋亡的诱导［9］以及联合化疗药物以及非常规化疗药等形成放化疗增敏等作用［9－11］。本实验基于2－DG对肿瘤的抑制作用以及联合抑制作用［12］，使用2种不同种系的胰腺癌细胞系，观察2－DG联合广谱抗肿瘤药物顺铂对胰腺癌细胞系体外抑制作用以及凋亡的诱导作用。

材料与方法

1 细胞以及分组 人类胰腺癌细胞系1420（Mia）、1469（Panc－1）由西安交通大学病理实验室以及细胞生物实验室惠赠，每组正常培养以及传代，待稳定传代3～4代后投入使用。

2 主要试剂 DMEM（高糖，4500 mg/L）培养基购自Sig ma公司；胎牛血清购自Gibco公司；Annexin V－FITC凋亡试剂盒购自珠海健康元生物医药公司；顺铂冻干粉针（10 mg）购自齐鲁药业；MTT、DMSO购自Sig ma公司，caspase－3检测试剂盒购自碧云天生物公司。

3 主要仪器 离心机为西安交通大学病理实验室器材，酶联免疫检测仪为交通大学病理实验室器材，流式细胞仪为西安交通大学细胞与分子生物实验室器材。

4 操作步骤 ①细胞培养：将人类胰腺癌细胞系1420（Mia）、1469（Panc－1）细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，放置于37℃，5%CO2中孵育，待细胞进入对数期后，使用0．25%胰蛋白酶消化后，细胞离心传代。待细胞贴壁后，按照不同的实验方法进行处理。②MTT实验：取对数期生长的人类胰腺癌细胞系1420（Mia）、1469（Panc－1）细胞株各分成4组：空白对照组（仅加培养基）、2－DG组（培养基中增加梯度为1 mg/L的2－DG）、顺铂组（培养基中增加1 mg/L浓度的顺铂）、二药联合组（培养基中增加梯度为1 mg/L浓度的顺铂以及1 mg/L的2－DG）。胰酶消化后，调整细胞浓度至3000个/ml，种植于96孔板中，每组设立6个复孔。2d更换一次培养液。24h和48h后，每孔加入200μl CCK－8后静置4h，移至酶联免疫检测仪上测定各孔的细胞在490n m处的吸光值［D490］。以时间为横坐标，细胞抑制率为纵坐标，绘制出细胞的生长以及抑制曲线。③凋亡和通路检测：给药8h后，使用Annexin V－FITC凋亡试剂盒进行细胞凋亡检测和caspase－3活性检测。

5 实验数据处理与统计学分析 实验获取的数据以均数±标准差来表示，使用SPSS19．0进行单因素方差分析，α＝0．05。

结 果

经过24h、48h MTT测试及8h凋亡检测得知，2－DG对2种不同种系的细胞系都有不同程度的抑制作用。而对细胞的抑制强度基本与凋亡实验结果平行，提示2－DG对胰腺癌细胞系的抑制作用可能和对caspase－3通路介导的凋亡诱导有关。

1 MTT检测 2－DG和顺铂联合使用对肿瘤细胞活力的影响，和空白对照组比较，2－DG和顺铂均可降低肿瘤细胞的活力，二药联合对细胞活力影响更为明显，各组结果均存在统计学差异。见图1、2。

图1 Panc－1细胞使用不同处理的24h和48h MTT结果

图2 Mia细胞使用不同处理的24h和48h MTT结果

2 细胞凋亡检测 由机制上而言，2－DG在低糖状态下对细胞作用更明显，本次实验进行低糖状态下的凋亡检测。图a为未处理的对照组凋亡率；图b为单用2－DG组的凋亡率；图c为单用顺铂组的凋亡率；图d为二药联合组的凋亡率。见图3、4。

图3 Panc－1细胞经不同处理后8h凋亡检测

3 caspase－3检测 caspase－3检测结果提示，2－DG对细胞的凋亡可能通过caspase－3活性的增强来诱导细胞的凋亡，以下为给药8h后使用caspase－3凋亡试剂盒检测的细胞caspase－3活性，提示2－DG对细胞的凋亡诱导可能是通过caspase－3凋亡途径起作用的，见图5。

图4 Mia细胞经不同处理后8h凋亡检测

图5 Panc－1细胞与Mia细胞经不同处理后8h caspase－3活性检测结果

讨 论

除了经典的糖酵解抑制途径，2－DG还可以抑制肿瘤细胞的糖基化，干扰蛋白质的组装。未组装的蛋白质沉积在内质网上，可以对细胞造成应激，并启动一系列的凋亡通路来诱导细胞的凋亡［13］。

在本实验中证实，2－DG在对2种胰腺癌的细胞系中，都有或强或弱的抑制作用。对于作用的机制，本实验初步观察到的，是2－DG通过诱导caspase－3通路对各种胰腺癌细胞的凋亡诱导作用，这与文献报道一致［9］。这可能是药物抑制胰腺癌细胞的机制之一，提示2－DG对广谱抗肿瘤药物顺铂可能存在协同作用。更多的机制，以及引起凋亡的进一步机制，还需要进一步的实验来证实。

目前国际上对2－DG在体外试验有一系列的研究，然在人体试验上缺乏足够的实验数据［14］，可能的原因是口服给药的首关消除或静脉给药的红细胞毒性的考虑。随着加速器质谱等痕量定量技术的逐渐完善，对2－DG的机制及临床研究将有进一步的深化。

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