雌激素对人皮肤成纤维细胞骨形态发生蛋白-2 mRNA表达的影响

谭 拯，李 勤，程 飚，余文林，熊 杰

皮肤是雌激素敏感器官[1]，雌激素参与了皮肤的许多生理及病理过程。人类皮肤衰老与体内性激素水平降低有关[2]。成纤维细胞是皮肤皱纹形成的主要效应细胞，它的生物学特性改变决定了皮肤老化[3]。骨形态发生蛋白( bone morphogenetic proteins, BMPs)是一种酸性多肽物质，对细胞的增生和分化具有重要调节作用[4]。目前，雌激素与BMP-2 相互作用的研究主要集中在骨组织，对二者在皮肤老化方面的研究尚未见报道。本研究通过体外培养人正常皮肤成纤维细胞，观察雌激素对细胞中BMP-2 mRNA 表达的影响，探讨BMP-2 在雌激素参与的皮肤衰老过程中可能起到的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 本院整形外科门诊常规手术切除的2 例健康成年男性眼部非皱纹皮肤。

1.1.2 试剂和设备 亚甲基双丙烯酰胺（DMEM）、胎牛血清（Gibco）， Dispase Ⅱ、胰蛋白酶、Triton X100（Sigma）；Trizol 试剂及反转录酶试剂盒（Takala）、TaqDNA 聚合酶（Promega）、PCR 扩增仪（Biometra）。

1.2 方法

1.2.1 人皮肤成纤维细胞分离 根据文献[5,6]的方法分离人皮肤成纤维细胞（HSFB），具体操作步骤如下：①原代培养：用含青霉素和链霉素的PBS 将手术切除的正常皮肤冲洗3 次，每次约10 s，用血管钳尽量去除皮下结缔组织；其后用眼科剪将皮肤剪成小块状，真皮面朝下平铺于平皿中，加入4 %蛋白酶Ⅱ 4 ℃条件下过夜；次日分离表皮、真皮，将真皮剪切成小块，接种于培养皿中，置于37 ℃、5 %CO2恒温培养箱中培养1 h，另加入少量含20%优等胎牛血清的DMEM 培养液，次日加入足量培养基继续培养，以后每3 d 换液1 次。②传代：用0.25%胰酶、0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化约1 min，在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入含10%优等胎牛血清的DMEM 终止消化，用吸管吹打细胞，以1∶3 比例传代培养。③形态学观察：利用倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态变化。第3 ～6 代细胞用于正式实验。实验共分两组，对照组（加入PBS）和雌激素处理组。分别取不同代数的HSFB 做实验，每代取3 皿细胞作为重复实验。雌激素处理组在培养基中加入1×10-6mol/L 17-β-雌二醇刺激24 h后与对照组培养基同时提取RNA。

1.2.2 引物设计与合成 引物设计与合成参考文献[7]，BMP-2 基因引物序列由上海英骏生物技术有限公司合成，其上游序列为5’-CACCGACCCGTCAGCT-3’，下游序列为5’-ATGAATTCGGTTGACCAAT-3’。扩增目的基因片段长度532 bp；GAPDH 上游序列为5’-ATGGCGGGCCAATAAATT-3’，下游序列为5’-CCATAAGGGAACGGACGT-3’。扩增目的基因片段长度为178 bp。

1.2.3 细胞总RNA 提取 灭酶EP 管收集细胞上清保存备用，用冷PBS 冲洗细胞2 次；加入 1 ml Trizol，吹打细胞至液体澄清（生化：摇动混匀后室温孵育10 min）；将裂解液转移至1.5 ml 灭酶EP 管中，加入氯仿0.2 ml（1/5 Trizol 体积），剧烈震摇15 s，置室温5 min；4 ℃、12 000×g（相对离心力12 300）离心15 min；小心收集上层水相约0.5 ml 置于另一1.5 ml 灭酶EP 管中；加入0.5 ml 异丙醇，用力摇匀，置室温10 min；4 ℃、12 000×g 离心10 min，可见RNA 沉淀。倒弃上清，用滤纸吸干管口余液，加入预冷的75%灭酶异醇1 ml，用指轻弹管壁使 RNA 沉淀飘起。4 ℃、7 500×g（相对离心力7 700）离心5 min，沉淀即为总RNA；弃上清，真空干燥约4 min 或空气中干燥5 ～10 min，加入20 µl（30 µl）DEPC 水。56 ℃水浴＜10 min 助溶，取少量测A 值，其余-70℃保存备用。

1.2.4 反转录cDNA ①在0.5 ml 微量离心管中，加入总RNA 1 ～5 μg，补充适量的去离子水使总体积达11 μl。在管中加10 μmol/L T 重复寡核苷酸[Oligo(dT)]12 ～18 μl，轻轻混匀，离心。②70 ℃加热10 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1 min。再加入下列试剂的混合物：10×PCR buffer 2 μl、25 mmol/L MgCl22 μl、10 mmol/L dNTP mix 1 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl，轻轻混匀，离心。42 ℃孵育2 ～5 min。③加入Superscript Ⅱ1 μl ，在42 ℃水浴中孵育50 min。④于70 ℃加热15 min 终止反应。⑤加入RNase H 1 μl，37 ℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20 ℃保存备用。

1.2.5 RT-PCR PCR 总反应体系为25 μl，其中模板量为2 μl，引物浓度为0.5 μmol/L、0.1 mmol/L dNTP、1.25 U Taq 聚合酶和1×PCR 缓冲液。共循环数40次，其中BMP-2 每一循环包括：94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min 和68 ℃ 1 min； 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）反应条件同BMP-2。

1.2.6 凝胶电泳 PCR 产物在2%琼脂糖凝胶中电泳分析结果。凝胶成像分析系统（GSD-7500，美国）对PCR 扩增条带进行图像扫描，测吸光度值，用BMP-2与GAPDH 的比值表示BMP-2 mRNA 的相对含量。

1.2.7 流式细胞仪检测雌激素、BMP-2 对成纤维细胞周期的影响 将第3 代培养细胞常规消化，用培养液调整细胞密度为1×108/L，接种于6 孔培养板， 每孔2 ml 培养24 h。该实验总共分3 组，对照组、雌激素组和BMP-2 组，分别取第3 代后不同代数的培养细胞共3 代，每代细胞取3 皿细胞作重复实验。用70%乙醇将17-β-雌二醇稀释成1×10-6mol/L，分别取2 μl 加入含2 ml 培养基的培养板内。对照组采用PBS 替代，而BMP-2 组BMP-2 浓度根据文献研究采取0.4 μg/ml。继续培养至倒置显微镜下观察细胞生长接近80% 后终止培养，常规胰酶消化、PBS 洗涤、75%冷乙醇固定后，在流式细胞仪（Elite，贝克曼库尔特公司，美国）上检测各雌激素浓度组的细胞周期时相细胞比。

1.3 统计学方法

利用SPSS13.0 统计软件对数据进行分析，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用配对t 检验，多组间比较采用Oneway ANOVA 方法进行，P ＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HSFB原代培养

显微镜下观察成纤维细胞生长良好，为长梭形。

2.2 不同刺激组HSFB的周期分布

成纤维细胞在浓度为1×10-6mol/L 的17-β-雌二醇和0.4 μg/ml 的BMP-2 作用下，处于S 期的细胞百分数明显上升，增生指数与对照组相比差异均有统计学意义（P ＜0.01）；雌激素处理组处于S 期的细胞百分数也较BMP-2 组增加（P ＜0.05）（表1）。

表1 不同刺激组HSFB的周期分布

2.3 PCR产物和琼脂糖凝胶电泳结果

PCR 产物和琼脂糖凝胶电泳结果见图1，产物片段大小与待扩增的基因片段长度相一致。雌激素组BMP-2 mRNA 相对值为8.43±0.43，而对照组BMP-2 mRNA 相对值为4.65±0.32，两组相比差异有统计学意义（P ＜0.01）。

图1 BMP-2和GAPDH基因产物PCR扩增图

3 讨论

皮肤衰老主要表现为皮肤的胶原纤维和基质结构以及代谢发生改变，出现胶原交联、溶解性下降、脂褐素堆积、血管弹性下降，从而发生皮肤松弛变薄、色斑产生等一系列变化。皮肤衰老受年龄、外部环境及体内激素水平的影响[8]。皮肤是一个雌激素敏感器官[1]，雌激素参与了皮肤的许多生理及病理过程，人类皮肤衰老与体内性激素水平降低有关，但二者间的内在联系和机制目前尚不十分清楚。有研究表明，雌激素可通过成纤维细胞上的受体直接调控该细胞的增生，提高其活性，增加胶原含量[7,9,10]。另外，通过皮肤上的雌激素受体，雌激素也可以刺激角质形成细胞增生，增加和保持真皮中的胶原蛋白，减少基质金属蛋白酶（MMP）的表达，增加真皮中黏多糖和透明质酸的含量[11]，从而保持皮肤厚度、弹性及水分，并保证角质层的屏障功能。

BMPs 属于TGF -β 超家族，在胚胎发生和发育、组织与细胞的分化和增生等方面起重要作用[4]。研究表明，雌激素可以上调成骨细胞系MN7 细胞BMP-2 mRNA 的表达[12,13]。

雌激素对HSFB 增生的影响与其浓度有关。周武等[14]发现，雌激素的浓度为1×10-6～1×10-10mol/L时，可明显促进HSFB 的增生；但雌激素浓度＞10-6mol/ L 时，其对细胞增生有抑制作用，浓度＜ 1×10-12mol/ L 时，对细胞增生无影响。与雌激素相同，BMP-2 对HSFB 增生的影响也与浓度有关。邓廉夫等[15]发现，BMP-2 浓度在0.4 μg/ml 时成纤维细胞增生迅速，因此本实验选取该浓度进行实验。我们发现，用雌二醇和BMP-2 刺激培养细胞后，处于S 期的细胞百分数明显上升，其中雌激素组高于BMP-2组。该结果表明，雌激素与BMP-2 均可促进HSFB增生。另雌激素刺激后，培养细胞BMP-2 mRNA 表达增加，表明雌激素刺激可有效增加细胞BMP-2 表达，而BMP-2 表达增加可促进HSFB 增生。因此，本研究推测，BMP-2 有可能是雌激素刺激后的一个下游分子，雌激素有可能通过BMP-2 上调成纤维细胞活性，促进成纤维细胞增生及增加胶原含量，从而成为延缓由于激素缺乏引起的皮肤衰老的重要机制之一。但因目前尚未见对于雌激素、BMP-2 及皮肤相关性研究，未来实验研究应集中在雌激素刺激成纤维细胞后BMP-2 表达、BMP-2 下游通路及BMP-2 下游通路激活后成纤维细胞生物学效应的改变等方面。

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