高粱抗丝黑穗病遗传与分子育种

张春来，杨慧勇，柳青山，王花云，赵威军，张福耀，董良利

（山西省农业科学院高粱研究所，山西省高粱工程技术研究中心，山西晋中030600）

高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）属于单子叶植物纲禾本科高粱属，是一年生高大草本植物，表皮覆盖蜡质，具典型的C4植物特化光合作用器官、高光合效率功能和高产潜力，喜温、抗旱、耐涝、耐瘠薄和耐盐碱性，种植面积在世界粮食作物中占第5位（前4位依次为玉米、小麦、水稻、大麦），主要分布在非洲、亚洲、美洲的干旱和半干旱地区。高粱籽粒多作饲料和食用，也较多用于酿造；其茎秆除作燃料外，也用作建材和造纸原料。高粱的其他栽培类型还有饲草高粱、能源甜高粱和帚用高粱。

一般认为，高粱起源于非洲。我国有5 000 a以上的高粱栽培历史，也是重要的起源和扩散地。全国高粱栽培区分为东北春播早熟区、华北春播晚熟区、华东春夏兼播区和西南等南方区。2004年高粱种植面积78.5万hm2，总产量311.3万t；2008年种植面积48.9万hm2，总产量183.7万t。发展和稳定高粱生产，对我国农业及相关产业发展尤为重要。

丝黑穗病是遍布全世界的重要高粱病害，是影响我国高粱生产发展的主要病害之一。其在东北、华北和西南高粱产区每年都有发生，发病率一般为3%～5%，严重的可达10%～40%，有时高达70%，给生产造成很大损失，是造成近年来高粱产量不高和不稳的主要因素[1]。实践证明，应用抗病品种是控制该病的最有效途径，但是，由于病菌与抗源的协同进化，不断产生新的致病性强的生理小种，导致原有品种丧失抗性。抗病育种需要拥有较多的抗病种质和有效的种质筛选鉴定方法，也需掌握病菌生理小种变化趋势，明确抗病种质的抗病机制和抗病性基因遗传，才能对改良群体后代进行准确的选择。

1 高粱丝黑穗病、病原菌及其生理分化

引起高粱丝黑穗病的病原菌为丝轴黑粉菌（Sporisorium reilianum（Kühn）Langdon et Full，别名 Sphacelotheca reiliana（Kühn）Clint.），属担子菌纲黑粉菌目黑粉菌科。该菌是以土壤传播为主，主要侵染源为散落于土壤或粪肥内的丝轴黑粉菌冬孢子。冬孢子萌发后以双核菌丝侵入高粱幼芽，从种子萌发至芽长1.5 cm期间为其最适侵染期。侵入的菌丝初期在生长锥下部组织中，40 d后进入内部，60 d后进入分化的花芽中。因此，该病是系统侵染病害。土壤温度及含水量与发病密切相关，在土温28℃和土壤含水量15%时发病率最高。春播时，土壤温度偏低或覆土过厚，幼苗出土缓慢易发病。连作地发病较重。

病株在生长早期症状不明显，但病株矮于健株。发病初期病穗穗苞很紧，下部膨大，旗叶直挺，剥开可见内生白色棒状物，即乌米。苞叶里的乌米初期小、指状，逐渐长大，后中部膨大为圆柱状，较坚硬。乌米在发育进程中，内部组织由白变黑，后开裂，乌米从苞叶内外伸，表面被覆的白膜也破裂开来，露出黑色丝状物及黑粉，即残存的花序维管束组织和病菌冬孢子。叶片染病在叶片上形成红紫色条状斑，扩展后呈长梭形条斑，后期条斑中部破裂，病斑上产生黑色孢子堆，孢子量不大。散落在土壤中的病菌能存活1 a，冬孢子深埋土内可存活3 a。

国内外许多研究表明，高粱丝黑穗病菌有明显的生理分化现象，存在不同的生理小种。美国早期报导有4个生理小种，近来还出现了新菌株[2]。Herrera等[3]指出，墨西哥有3个丝黑穗病菌生理小种。吴新兰等[4]报道了我国的2个生理小种：1号小种对中国高粱和甜玉米致病力强，对甜高粱苏马克致病力弱，对白卡佛尔和Tx3197A几乎不侵染；2号小种对Tx3197A、白卡佛尔和甜高粱苏马克致病力强，而对中国高粱和甜玉米致病力弱。徐秀德等[5]在辽宁省营口等地发现第3个生理小种，该小种能侵染1，2号小种不侵染的Tx622A和Tx622B（选为鉴别寄主），具有很强的致病力，并证明中国生理小种与美国生理小种相比具有完全不同的毒力特征。张福耀等[6-7]报道了在山西省高平发现的新生理小种，该小种对A2V4、晋杂12号有较强的致病力，而对3号小种致病的7501B，Tx7078，B35不能侵染，定名为4号生理小种。

徐秀德等[8]应用随机引物对不同地理来源、不同寄主和经寄主致病力测定的高粱丝黑穗病菌2，3号生理小种的10个菌株的DNA进行分析，所产生的RAPD结果表明，S.reilianum具有丰富的种内遗传多样性,存在明显的分化现象。经聚类分析，可将供试菌株大致分成2组，辽宁清原H2和黑龙江绥化H9菌株为一组，辽宁沈阳（H3）、阜新（H1）、营口（H10）、山西榆次（H4）、吉林四平（H5）、黑龙江哈尔滨（H6）、河北张家口（H8）等高粱丝黑穗病菌株以及辽宁沈阳的玉米丝黑穗病菌株（H7）为另一组，并且同一组内的DNA多态性亦有差异。因此，高粱丝黑穗病菌2号生理小种和3号小种间在分子水平上存在明显差异。Prom等[9]用AFLP法对高粱和玉米的S.reilianum分离物进行了分子分析，包括44个美国德州、2个乌干达、1个马里的高粱分离物和2个墨西哥玉米分离物，发现玉米和高粱分离物有很大非相似性（50%），聚类分析可将82%的高粱分离物划分为4组，除了2个德州6号小种外，对基因漂流无地理或其他限制。

真菌致病因子有MAP激酶、钙依磷酸酶B（calcineuin B）和 cyclophilin等。Schirawski等[10]研究结果显示，寄生性病原菌如玉米丝轴黑粉菌和黑粉菌（Ustilago maydis）可通过分泌效应子蛋白（SEP）与寄主建立亲密关系。对上述真菌的基因组测序发现，许多编码SEP的基因具保守性，呈线性关系。SEPs分泌在寄主胞质中，在病原菌成功侵入并建立寄生关系时，会抑制寄主的免疫反应。由于SEP与寄主蛋白作用，会快速进化。在S.reilianum上找到43个低保守区，主要编码SEP和以前鉴定出的毒力基因簇，进一步通过缺失突变显示了4个未知多样性区与毒力功能相关。该研究突显了比较基因组学在鉴定近缘种致病毒力因子上的优越性。

2 抗丝黑穗病种质资源鉴定与抗性机制

抗丝黑穗病种质鉴定的常用接种法为土壤接种和种子接种，徐秀德等[11]在我国首创采用寄主皮下组织注射接种技术鉴定抗病高粱资源。Prom等[9]报道了针管注射和放置培养基接种法。徐秀德等[11]用高粱丝黑穗病菌2，3号生理小种，采用上述3种接种法对75份中外高世代材料进行同步抗性评价，明确了7050A/B，Tx378A/B，TNS30，SA281，莲塘矮，GW4386，GW4388 等 38 份高粱育种试材在不同接种方法下对高粱丝黑穗病菌2，3号小种均表现免疫，是具有对高粱丝黑穗病多抗性的育种试材。柳青山等[12]采用土壤接种法也筛选到较多抗性种质。抗病育种主要采用杂交与回交相结合，将抗病基因导入需改良的品系中[1，12-13]。目前，生产上抗丝黑穗病的杂交种有：黑杂34、黑杂 46、齐杂 1号、晋杂 22号、晋杂26号、晋杂102号、晋糯2号、冀杂1号、辽杂10号、辽杂11号、辽杂12号、辽饲杂2号等。抗病亲本有：A_2Sx3197（13），46038，Tx-437，LRB204，SPL132A/B（421A/B），7050A/B，黑龙 14A/B，715 2A/B，吉农105A/B等。

对丝黑穗病菌抗性机制在玉米上报道较多。李兴红等[14]研究表明，冬孢子在感病的玉米材料胚芽鞘上的萌发率（13.2%～18.8%）显著高于在抗病的玉米材料胚芽鞘上的萌发率（6.6%～7.1%）；感病幼苗中维生素C（Vc）和总糖的含量，显著高于抗病材料，且二者与冬孢子在胚芽鞘上的萌发率呈显著的正相关（r＝0.85，0.86），揭示了玉米幼苗期抗侵入的固有抗性；受玉米丝黑穗病菌侵染后，幼苗胚芽鞘内表皮在0.53 mol/L高渗蔗糖溶液中感病材料丧失质壁分离能力的细胞百分率高干抗病材料。贺字典等[15]研究表明，玉米对丝黑穗病菌的抗性与胚根和胚芽内的N，P，K含量呈正相关，与Vc和可溶性糖含量呈负相关。当病菌侵入后抗病品种苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化物酶（POD）活性上升幅度高于感病品种，而多酚氧化酶（PPO）、酯酶（EST）和超氧化物歧化酶（SOD）在感病品种中上升幅度高。倪深等[16]采用丝轴黑粉菌基因组的特异引物和PCR技术，分别对幼苗期的根、叶和成熟期的根、茎、叶、雄穗生长锥DNA进行PCR扩增，结果表明，特异引物的PCR技术不仅能够在早期准确鉴定玉米幼苗是否受到病菌的侵染，而且可以跟踪丝轴黑粉菌在体内扩展进程，认为玉米对丝黑穗病的抗性差异主要表现为抗侵染和抗扩展，抽穗期雄穗对病瘿的形成不能表现出明显的抗性效应。对高粱丝黑穗病抗性机制的研究较少。刘旭[17]研究表明，高粱苗期抗性品种叶片内SOD和POD活性、可溶性糖含量显著高于感性品种，PPO，PAL，细胞壁酶PG活性无明显差异；分蘖期抗性品种PG，PAL活性显著高于感性品种，而SOD，POD，PPO，PG活性以及可溶性糖含量均无明显差异。

3 抗丝黑穗病遗传与抗病基因的分子标记

曹如槐等[18]1981—1985年用人工接种1号小种，按照不完全双列杂交设计对17个抗性不同的品种（系）进行了对丝黑穗病的抗性遗传研究，结果表明，高粱对丝黑穗病的抗性遗传方式因品种而异，有的品种（系）具数量性状遗传特点，有的则具有质量性状遗传特点，抗病性属数量性状遗传的品种（系），其抗性主要是受加性基因控制。杨晓光等[19]研究指出，高粱对2号小种的抗病性受2对非等位基因控制，且存在功能上的差异，双亲之一抗病，杂种1代未必都抗病，只有纯合显性基因控制的抗原，其F1的抗性才可靠。高粱对3号小种的抗病性受2～3对非等位基因控制，且基因间存在互作效应，还可能有修饰基因参与。徐秀德等[20]在人工接种条件下，用6个抗性不同的高粱种质，按照不完全双列杂交设计，进行了高粱对丝黑穗病菌3号小种的抗性遗传研究，结果表明，多数试材的抗、感性遗传受质量性状控制，只要亲本之一为免疫，则F1表现免疫或高抗，可能是1～2对非等位主效基因的作用，还有微效基因的加性效应。邹剑秋等[21]的抗性遗传结果与此相近。

常规育种的表型选择易受环境和人为因素影响，降低了选择的准确性和速效性。为了提高抗病性选择效率，早期进行分子检测，需要对抗病性数量位点（QTL）进行定位和作图，建立与其紧密连锁的AFLP，SSR和SNP等分子标记，进一步精细作图也可最终将抗病基因克隆。邹剑秋等[21]采用SSR技术，应用分离群体分组分析法，分别利用恢复系分离群体（2381R/矮四）和保持系分离群体（Tx622B/7050B），筛选抗丝黑穗病3号生理小种基因的分子标记，得到了2个在抗病品系中稳定出现、可作为高粱抗丝黑穗病3号生理小种基因标记应用的SSR标记，即Xtxp13和Xtxp145，其分别位于第2号染色体和第9号染色体上，距离抗病位点的遗传图距分别约为9.6，10.4 cM，认为高粱对丝黑穗病菌3号生理小种的抗性可能受2对彼此独立的非等位基因控制，并且基因之间存在着互作效应；筛选SSR标记时发现，高粱抗丝黑穗病基因的分子标记较易在保持系群体中找到，在恢复系群体中DNA片段多态性较少，表明恢复系和保持系在抗性机制上可能存在差异。Oh等[22]以SC325×RTx7078杂交的F2和F3材料，用RFLP和RAPD技术，对美国高粱丝轴黑粉菌5号小种的抗性位点Shs1进行分子标记，发现它与RFLP位点pSbTXS560和pSbTXS1294，RAPD位点OPG5连锁，定位于第8染色体94.1 cM处。目前，我们正在应用SSR和SNP分子标记体系对4号小种的抗性位点进行定位和作图，以便更准确地对抗病基因型进行选择。

4 抗病基因分子生物学与转基因技术培育抗病种质

转基因技术已成为重要的育种工具，培育的转基因棉花、大豆、甜菜、玉米和水稻品种已用于生产。最有效的转基因方法为农杆菌介导转化法，其次为基因枪微粒子射击法。常用的目的基因有病程相关蛋白、类NBS-LRR抗病基因、抗病信号传导基因和有关WRKY转录因子等。应用分子生物学技术研究植物与病原菌关系，在拟南芥、烟草和水稻等作物抗病反应信号传导上，建立了水杨酸（SA）途径、茉莉醛（JA）途径和乙烯（ETH）途径[23]。一般SA途径抗寄生性病原（如丝黑穗病）、JA途径和ETH途径抗腐生性病原和蚜虫等。我们用BLAST法搜寻高粱基因组抗病相关基因的结果如表1所示。

表1 BLAST搜寻高粱基因组抗病反应信号传导基因的结果

Paterson等[24]在进行高粱基因组测序时已发现有211个NBS-LRR抗病基因，主要为CC-型，在5号染色体上最多（62个），仅Sb02g005860和Sb02g036630含TIR结构域，但都不含NBS结构域。Cheng等[25]鉴定出274个NBS基因，其中50个为非典型的NBS基因，划分为CNL，CN，CNLX，CNX，CNXL，CXN，NX，N，NL 和 NLX 共10种类型。NBS基因在染色体上成簇分布，系在进化过程中过度复制形成。在这些NBS基因中很可能存在抗丝黑穗病的基因。

Zuther等[26]在比较受高粱专化型S.reilianum f.sp.reilianum和玉米专化型S.reilianum f.sp.Zeae侵染高粱时，发现植保素luteolinidin的合成与抗病性相关，luteolinidin可延缓S.reilianum这2个专化型的营养生长，受病菌诱导表达的高粱基因SbDFR3（Sb04g004290）控制该途径。Zhang等[27]对玉米丝黑穗病菌侵染抗感病材料根部早期进行了数字化基因表达分析，观察到病程相关蛋白、GST活性、活性氧种类和木质素合成上的变化。Wang等[28]用Illumina MaizeSNP50基因芯片对144个近交系进行了全基因组关联分析（GWAS），找到18个新的抗丝黑穗病基因，它们属于抗病基因、抗病信号传导基因和其他具抗病功能的基因。左为亮等[29]定位了玉米高抗丝黑穗病亲本吉1037和高感亲本黄早四的BC1F1群体的一个主效QTL-qHSR1，它位于第2号染色体bin2.09的位置，能够解释表型变异率36%。使用回交群体和基于重组后代的连续精细定位方法将主效QTL-qHSR定位于分子标记STS1M3和STS3M1之间。通过对筛选得到的黄早四和Mo17的BAC克隆进行测序，发现定位的qHSR1区域在Mo17中为152 kb，而黄早四中的相应区段仅为5 kb，缺失的片段大小达147 kb。通过对Mo17的这一区段进行基因预测，发现了一个编码细胞壁相关的激酶（WAK）的基因ZmWAK，推测为qHSR1候选基因。WAK激酶是一个受体类蛋白，主要定位在细胞膜上。ZmWAK主要在吉1037的根、茎、叶中表达，其中以10 d幼苗期的茎中表达量最高，并且在接种丝轴黑粉菌后表达量上升。含ZmWAK的转基因后代植株与对照相比，抗病率明显上升13%～20%。通过对来自世界各地的520份自交系进行分析，发现ZmWAK基因的缺失在自交系中是一种普遍现象，约占总数的20%。对其中的49份国内材料进行性状鉴定，发现在34份抗病材料中，总共有32份材料带有ZmWAK基因；而在15份感病的自交系中，有7份自交系在这个基因上发生缺失，表明ZmWAK基因可能在玉米对丝黑穗病的抗病途径中起重要作用。

甘蔗粒黑粉病菌（Sporisorium scitaminean）和鞭黑粉菌（Ustilago scitaminean）是高粱丝轴黑粉菌S.reilianum的近缘种。LaO等[30]用cDNAAFLP研究了甘蔗与S.scitaminean作用时基因差异表达，在所得的64个转录片段中，67%的抗病品种发生上调，包括氧猝发、防御反应、木质素合成、乙烯和生长素途径。Que等[31]用双向等电聚焦电泳（2-DE）和MALDI-TOF-TOF/MS研究了受S.scitaminean诱导的甘蔗蛋白，得到23个蛋白，其中20个与信号转导、抗病和光合有关。吴期滨等[32]应用Solexa高通量测序技术研究了高抗黑穗病的含有斑茅血缘的甘蔗无性系Ya05-179响应U.scitaminean侵染的表达谱分析与差异表达基因鉴定，在比较分析甘蔗黑穗病菌胁迫前后甘蔗幼芽RNA表达谱的基础上，获得2015条差异表达序列标签（ESTs），其中上调表达与下调表达各有1 125条和890条，进一步先从中筛选出差异表达倍数大于5的31条上调表达和17条下调表达的ESTs及MAPK信号级联传导途径中3条上调表达EST；作为探针种子序列进行电子克隆，获得了20条具有完整开放阅读框（ORF）的甘蔗差异表达基因cDNA全长序列，其中16条上调和4条下调表达，包括MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号级联传导途径中3个上调表达的基因BAK 1，Mapkk和Glo 1，及GT-3b，MYB和h/ACA共3个转录因子基因14个预测蛋白新基因。用RT-PCR技术，对BAK 1，Mapkk和Glo 1这3个基因进行克隆，获得3个基因的cDNA全长序列，上述基因推导的氨基酸序列的同源性比对和系统进化树分析显示，甘蔗BAK 1基因与高粱、Mapkk和Glo 1基因与玉米的相应基因同源性较高，分别达99%，97%和99%；用qRT-PCR技术显示，病原胁迫后0～12 h，抗、感病基因型中3个基因的表达量均上扬，且抗病基因型上扬幅度较大，推断这3个基因的表达在甘蔗抵御病原菌的侵染以及侵染后最初病程中起重要作用，且基因的表达与抗病性相关，但Glo 1在胁迫48 h后表达再次上扬，推断它在抗病中的作用机制与BAK 1和Mapkk基因存在一定的差异。该研究基于Solexa表达谱测序分析，挖掘甘蔗响应黑穗病菌侵染的差异表达基因，为进一步了解甘蔗对黑穗病的抗性机制奠定了基础，也对高粱抗丝黑穗病研究有所启发。

目前，基于农杆菌介导转化法和基因枪微粒子射击法在高粱上都有成功报道，但相关参数仍待进一步优化。石太渊等[33]用花粉管通道法将无毒广谱抗病基因PYH157导入高粱，获得了转基因植株；应用聚丙烯酰胺等电聚凝胶电泳蛋白质分析表明，PYH157已被整合到高粱基因组中并能表达，田间接种丝黑穗病试验中筛选出4个较抗病的转基因植株。杜建中等[34]报道了以几丁质酶基因转化抗丝黑穗病玉米的选育，以转基因导入玉米自交系海92-1所获得的转基因植株的种子作为试验材料，对T1，T2和T3株系的PCR检测结果说明，目的基因在转基因植株中可稳定遗传；田间抗病鉴定结果显示，转基因株系的发病率比当代对照株系明显减少2～4级，选育得到的纯合系06006和06012的发病率为0，表现出高抗病性。Allen等[35]将Toti-病毒抗真菌蛋白KP41在转基因玉米中系统表达，茎部和穗部接种抗黑粉病鉴定表明，转基因后代高抗U.maydis。

综上所述，应用转基因技术培育抗丝黑穗病的高粱研究还较少，但具抗丝黑穗病潜力的候选基因比较多，基因组学、转录组学和蛋白组学研究将会开发出更多的有用基因，当务之急是选择上述具几种抗病机制的基因，创制转基因植株，尽早选育出具有持久抗病性的转基因品种。

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