N-mPEG-O-季铵化壳聚糖微球的制备及其载药性能

王 军，李明春，辛梅华，张晓林，毛扬帆

（华侨大学材料科学与工程学院，环境友好功能材料教育部工程研究中心，福建 厦门 361021）

壳聚糖具有良好的生物降解性、生物相容性和低毒等优点，因此改性壳聚糖衍生物作为药物载体成为研究的热点。Wan等[1]合成了O-季铵化壳聚糖并以三聚磷酸钠（TPP）为交联剂制备纳米微粒，研究其对牛血清蛋白的载药结果表明O-季铵化壳聚糖纳米粒比壳聚糖纳米粒突释小。Zhang等[2]以TPP交联制备CS-mPEG纳米粒，对胰岛素的载药结果表明微粒具有壳聚糖的核心和聚乙二醇（PEG）的外壳；PEG取代度增加载药率增加，并且 PEG的引入使CS-mPEG微粒的释放率增大并具有缓释效果。Qu等[3]制备了N-mPEG-N-辛基-O-磺化壳聚糖载紫杉醇胶束，体内外评价结果表明PEG基团的引入使胶束在静脉注射时更稳定，具有缓释效果。Liang等[4]合成PEG接枝季铵盐壳聚糖并和胆固醇制备脂质体，对紫杉醇的载药研究表明其对紫杉醇具有较好的包封率和载药量，载药脂质体在PBS7.4的缓冲溶液中有较好的缓释效果，两周后累积释放率为80%～86%。综上可见，季铵化改性壳聚糖具有减小突释和弱碱性介质中缓释的性能，而mPEG改性壳聚糖能提高载药率、使药物具有缓释效果等功能，将两者结合在一起有望制备载药性能更优的壳聚糖衍生物。

载药微球具有延长药物在体内的半衰期、保护药物和控制药物释放等特点。Guerrero等[5]制备戊二醛交联壳聚糖微球，对酮替芬的载药量为 92 μg/mg，在 pH 值 7.4下能缓释 50～100 h。Shavi等[6]制备交联壳聚糖微球，对阿纳托唑的载药结果表明其具有缓释效果，48 h后小鼠血药浓度依然可检测。但是目前报道的载药壳聚糖微球，大多以TPP和戊二醛为交联剂存在着微球稳定性和细胞毒性等问题[7]。本文以反应条件温和、反应效率高的水溶性二乙烯基砜为交联剂[8]制备N-mPEG -O-季铵化壳聚糖微球（合成路线见图 1），以酮洛芬为模型药物研究引入mPEG和季铵盐基团对改性壳聚糖微球载药和释放行为的影响，为PEG进一步改性的季铵化壳聚糖微球在药物缓控释中的应用提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

FD-1B-50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器公司）；UV-3100PC紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）； NEXUSU 470型傅里叶变换红外光谱仪（美国Nicolet公司）；AvanceⅡ型核磁共振分析仪（瑞士Bruker公司）；VARIO EL Ⅲ元素分析仪（德国 Elementa 公司）；S-4800型场发射扫描电子显微镜（日本日立公司）。

壳聚糖（CS，DD%=92.85%，=3×105）浙江金壳生物化学有限公司；聚乙二醇单甲醚（mPEG，=1000），上海晶纯实业有限公司；3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵（CTA），实验室自制[9]；二甲基亚砜（DMSO），上海国药集团化学试剂公司；二乙烯基砜（DVS），上海海曲化工有限公司；酮洛芬（KP），武穴市迅达药业；其它试剂均为市售分析纯。

1.2 mPEG-CHO的合成

[10]并作适当的修改，具体如下：将4g mPEG溶解于9 mL DMSO/CHCl3（体积比5/1）混合溶液中，在N2保护下滴入10 mL DMSO/乙酸酐（体积比4/1）混合液, 室温反应10h。冰乙醚中沉淀，抽滤，产物用少量CHCl3溶解后再用冰乙醚沉淀，反复3次抽滤得醛化的mPEG。30℃真空干燥得mPEG-CHO。

1.3 N-mPEG-O-季铵化壳聚糖的合成

按照文献[9]制备O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（QACS），然后将2 g QACS分散于50%甲醇/水溶液中, 加入mPEG-CHO的甲醇溶液，室温反应4 h，NaBH4还原。产物用蒸馏水透析3天，冷冻干燥得QACS-mPEG。

1.4 N-mPEG-O-季铵化壳聚糖微球的制备

参考文献[11]制备 DVS交联微球，将 2 g QACS-mPEG溶于水后，倒入液体石蜡中，加入Span80 乳化30 min，滴入 0.97%的DVS-NaOH溶液，常温反应2 h后升温至40 ℃反应2 h。离心，取下层沉淀分别用石油醚、乙醇和水洗涤，40 ℃真空干燥得二乙烯基砜交联QACS-mPEG微球。

CS和QACS分别溶于2%HAc和水中，按照上述步骤制备CS和QACS微球。

图1 N-mPEG-O-季铵化壳聚糖的合成路线

1.5 产物的载药性能

1.5.1 QACS-mPEG微球的载药性能

取 50 mg QACS-mPEG微球加入 10 mL 60 mg/mL酮洛芬-乙醇溶液中，30 ℃恒温水浴振荡1 h（120 r/min），过滤，测定滤液在UV260 nm处的吸光值，由线性方程计算微球对酮洛芬的载药量Qe如下：

式中V和W分别为溶液的体积（mL）和微球的质量（mg）；C0和C1分别表示酮洛芬的初始浓度和载药后溶液中剩余酮洛芬的浓度（mg/mL）；Qe为载药量（mg/mg）。

同样方法测定CS和QACS交联微球的Qe值。

1.5.2 载药QACS-mPEG微球的药物释放行为

将上述载药微球过滤，40 ℃真空干燥。分别取50 mg载药QACS-mPEG微球加入装有30 mL模拟肠液和模拟胃液[9]的锥形瓶中，37 ℃恒温水浴振荡（120 r/min）。每隔一定时间取5 mL释放液并补充5 mL相应的释放介质，在UV260 nm测定吸光值，由相应的标准曲线计算释放液中酮洛芬的浓度并绘制释放曲线。

同样方法测定CS和QACS微球的释放曲线。

2 结果与讨论

2.1 产物的结构与表征

2.1.1 产物的红外光谱分析

采用KBr 压片法，测得N-mPEG-O-QACS微球制备过程中各产物的红外光谱如图2所示。

图2 合成产物的FTIR图

图2中a、b分别为mPEG和mPEG-CHO的FTIR谱图，2868 cm－1附近的吸收峰为聚乙二醇重复单元（—CH2—CH2—O—）中C—H的伸缩振动峰，1100 cm−1处为mPEG-CHO中醚键C—O—C的伸缩振动峰，b与a相比，1725 cm−1处出现了醛基的C=O伸缩振动吸收峰，证明mPEG已醛化[10]。c和d分别为CS和QACS的FTIR谱图，d与c相比较，在1484 cm−1出现季铵盐中甲基、亚甲基的C—H弯曲振动峰，1631 cm−1处出现季铵盐的反对称伸缩振动峰，991 cm−1处为季铵盐的吸收峰，证明在分子中季铵盐侧链的引入[9]。e为QACS-mPEG的FTIR谱图，与d相比较，1106 cm−1附近为mPEG的C—O—C伸缩振动吸收峰，1579 cm−1处—NH2吸收峰的减弱说明mPEG 被引入QACS的氨基上[10]。谱线f为二乙烯基砜交联的QACS-mPEG微球的FTIR谱图，与e相比，f 在1318 cm−1处为二乙烯砜中—SO2—的反对称伸缩振动峰，说明产物为DVS交联的QACS-mPEG。

2.1.2 产物的核磁共振分析

以D2O为溶剂，测得产物的1H NMR谱图如图3所示。其中δ4.76处是D2O的溶剂峰，δ3.41～3.44是—CH2（7）CH（8）（OH）CH2（9）N+(CH3)3（10）中H7、H8、H9位的质子峰，δ3.14是—N+(CH3)3（10）中H10的质子峰，说明季铵基团已被引入到壳聚糖的C6—OH上[12]。δ3.3是—NHCH2(e)CH2(d)中H(d)的质子峰，δ3.46～3.56是—OCH2CH2(c)和壳聚糖糖环残基上H3、H4、H5、H6位的质子峰，δ3.71是—CH2CH2(b)OCH3中H(b)的质子峰，δ3.16是—OCH3(a)中H(a)的质子峰，δ2.97是壳聚糖糖环残基上H2的质子峰，δ2.51是—NHCH2(e) CH2(d)—中H(e)的质子峰，δ1.97是壳聚糖中乙酰氨基（—NHCOCH3)中N上H的质子峰[10]。由FTIR和1H NMR说明产物为mPEG接枝季铵化壳聚糖衍生物。

2.1.3 产物的元素分析及取代度

N-mPEG-O-季铵化壳聚糖合成过程中各产物的元素分析结果见表1，表中CS（BA）和QACS（BA）分别为N-苯甲基壳聚糖和O-季铵化-N-苯甲基壳聚糖。用C/N计算各产物的取代度[12]，可见QACS、QACS-mPEG的取代度分别为59.20%和17.27%。

表1 合成产物的元素分析及取代度

图3 合成产物的1H NMR谱图

2.1.4 产物的溶解性试验

分别称取0.1 g样品于100 mL溶剂中，观察其溶解情况，结果见表2。

表2 产物的溶解性

由表2可以看出，CS只有在弱酸性条件下可以溶解，这是由于壳聚糖分子内和分子间的氢键作用。引入季铵基团后产物的水溶性明显变好，O-季铵化壳聚糖（QACS）可以溶解在水和弱酸性溶液中，而N-mPEG接枝O-季铵化壳聚糖可以溶解在水、弱酸和弱碱性介质中，拓宽了应用范围。

2.1.5 QACS-mPEG微球的SEM分析

用SEM观察微球的外观形貌，结果见图4，可见乙烯基砜交联QACS-mPEG微球球形较为完整，微球粒径范围在1～5 μm。

2.2 微球的载药性能

称取 60 ℃真空干燥至恒重的酮洛芬10 mg，乙醇溶解后转入100 mL容量瓶定容得浓度为0.1 mg/mL的酮洛芬-乙醇溶液，稀释得一系列浓度的标准溶液，在260 nm处测定吸光值，求得线性回归方程为A=0.0693C+0.0034（R2=0.9998），C为μg/mL，线性范围在0～30 μg/mL。

图4 QACS-mPEG微球的SEM图

分别称取CS、QACS和QACS-mPEG微球各50 mg，置于10 mL 60 mg/mL的酮洛芬-乙醇溶液中，30 ℃恒温水浴振荡1 h（120 r/min），过滤，测定滤液在UV260 nm处的吸光值，由酮洛芬-乙醇溶液的线性方程，计算各微球的载药量如表3所示。

由表3可见，在载药条件相同的情况下QACS微球的载药量优于CS微球，这是因为季铵化壳聚糖的—N+(CH3)3基团具有较高的正电性，与含有负电性基团的酮洛芬之间的静电缔合作用增强，载药量增加。而QACS-mPEG微球中除了季铵化壳聚糖和酮洛芬之间的静电缔合作用外，聚乙二醇基团与酮洛芬的氢键作用使载药量进一步提高[13]。

表3 微球的载药性能比较

2.3 载药微球的药物释放性能

按照上述同样方法配置一系列浓度的酮洛芬-模拟胃液和酮洛芬-模拟肠液溶液，在260 nm处测定吸光值，求得线性回归方程分别为A=0.0611C+0.0101（R2=0.9998）和A=0.0681C－0.007（R2=0.9999），C为μg/mL，线性范围0～30 μg/mL。

根据实验部分1.5.3节的操作，测得载药CS、QACS和QACS-mPEG微球在模拟胃液和肠液中的药物释放曲线如图5。

从图5中可以看出，CS微球在胃液和肠液中6～7 h药物的释放率达到90%以上。与CS微球不同，QACS微球在肠液中的释放较为缓慢，35 h后累积释放率为57%；而在胃液中，前7 h释放较快，35 h后释放平衡，累积释放为75.6 %。这可能是因为季铵盐基团和酮洛芬在不同pH值下存在形式不同，酮洛芬是一种酸性药物，在pH=7.4的模拟肠液中电离成负离子，而季铵盐基团在模拟肠液中以—N+(CH3)3的形式存在，与酮洛芬的静电吸引和缔合作用较强，释放缓慢；在pH=1.2的模拟胃液中酮洛芬主要以分子形式存在，季铵盐基团以N+(CH3)3Cl−形式存在，两者之间的静电吸引和缔合作用减弱，释放加快[14]。载药QACS-mPEG微球与载药QACS微球有相似的释放规律，即在模拟胃液中的释放速率大于在模拟肠液的释放速率，在胃液和肠液中35h后的累积释放率分别为81.4%和70.1%，且在肠液的缓释效果优于胃液，这可能是因为引入的mPEG含有—C—O—C—结构，能够与酮洛芬形成氢键，带正电的季铵盐基团能够与酮洛芬产生静电缔合作用，两者的共同作用使得QACS-mPEG微球在模拟肠液中有较好的缓释效果[15]。

3 结 论

图5 载药微球的药物释放曲线

将聚乙二醇单甲醚（mPEG）醛化改性后，通过西佛碱反应接枝到O-季铵化壳聚糖的NH2上，硼氢化钠还原制得N-mPEG接枝O-季铵化壳聚糖。用反相悬浮法制备二乙烯基砜交联QACS-mPEG微球。以酮洛芬为模型药物，研究微球的载药性能及释放行为。结果表明，QACS-mPEG微球对酮洛芬的载药量高于QACS微球和CS微球；载药QACS-mPEG微球的累积释放率大于QACS微球，并且在肠液的缓释效果优于胃液及载药QACS微球，在药物控释领域具有一定的应用前景。

参 考 文 献

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