木瓜蛋白酶酶解黑豆制备多肽

郑鸿雁，王 玉

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118)

黑豆，民间多称黑小豆和马科豆，有豆中之王的美称。黑豆在国外研究较少，国内已有初步研究。黑豆防老抗衰，药食俱佳，与黄豆同属大豆类。黑豆具有高蛋白、低热量的特性，其蛋白质含量高达36%～40%［1］。研究表明［2］，黑豆除富含优质蛋白质外，蛋白质水解后的多肽也含有许多的抗氧化成分，多肽易吸收还可以降低胆固醇等作用［3－4］。利用蛋白酶水解大豆蛋白，可以得到肽、氨基酸等营养物质，大大提高了大豆蛋白的营养价值［5］。酶水解法条件温和且不会造成环境污染［6］，所以本实验采用木瓜蛋白酶对黑豆豆粕进行水解，研究了制备多肽的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑豆豆粕粉 吉林公益源有机食品有限公司;木瓜蛋白酶(400U/mg) 北京鼎国生物试剂有限公司;四肽(Gly－Gly－Tyr－Arg) Sigma 公司;双缩脲试剂、三氯乙酸、氢氧化钠 均为分析纯。

水浴锅 国华电器有限公司;721型可见光分光光度计 尤尼科公司;低温高速台式离心机 赫莫;分析天平 sartouris。

1.2 实验方法

1.2.1 多肽含量测定

1.2.1.1 四肽标准曲线制作 先用5%TCA配置成1.8mg/mL的四肽溶液，然后再用此四肽溶液配制成浓度为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mg/mL的四肽溶液。各吸取3mL溶液放入对应空试管中，分别加入2mL双缩脲试剂，混匀，静止显色30min。分别于540nm下测吸光度值，以第一管为空白对照实验。以四肽浓度为横坐标值，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线［7］。

1.2.1.2 多肽转化率的测定 酶解完成后加入10mL 10%TCA 溶液［8］，静止 10min 后 3000r/min 离心10min，上清液为多肽溶液。取上清液1mL于试管中，加入2mL蒸馏水，加入双缩脲试剂2mL，显色30min后在540nm下测吸光度值。参照标准曲线，求出上清液中黑豆多肽的含量，计算多肽转化率。

A:根据标准曲线求出的横坐标浓度，mg/mL;B:豆粉克数，g;110:为100mL蒸馏水和10mL三氯乙酸;3:为倍数，1mL离心上清液加2mL蒸馏水相当于上清液稀释了3倍;50%:脱脂豆粉蛋白质含量为50%。

1.2.2 多肽溶液的制备 将一定量的黑豆豆粕粉加入到100mL蒸馏水中，配制成不同浓度的豆粕粉溶液，以2%的NaOH溶液调节pH等于6在水浴锅中加热搅拌。反应过程中用2%NaOH维持pH，温度恒定。酶解一定时间后即为多肽溶液。

1.2.3 制备多肽溶液单因素实验

1.2.3.1 加酶量对多肽转化率的影响 在100mL蒸馏水中加入2g黑豆豆粕粉，配制成0.02g/mL的豆粕粉溶液，保持pH等于6［9］，并且温度保持在55℃，酶解时间为 6h，分别选择 20000、25000、30000、35000、40000、45000U/g(U/g为酶活与底物质量比)的木瓜蛋白酶进行酶解黑豆豆粕制备多肽溶液，考察各组多肽的转化率。

1.2.3.2 豆粕粉浓度对多肽转化率的影响 在100mL 蒸馏水中分别加入 1、2、4、6、8、10g 的黑豆豆粕粉，分别配制成 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08g/mL 的豆粕粉溶液，加入木瓜蛋白酶，酶活为35000U/g(酶活/底物质量)，保持pH等于6，温度保持在55℃，酶解时间为6h。考察各组多肽的转化率。

1.2.3.3 温度对多肽转化率的影响 在100mL蒸馏水中加入2g黑豆豆粕粉，配制成0.02g/mL的豆粕粉溶液，木瓜蛋白酶酶活为35000U/g，保持pH等于6，酶解时间为6h。分别选择温度为50、55、60、65℃条件下酶解黑豆豆粕制备多肽溶液，考察各组多肽的转化率。

1.2.3.4 酶解时间对多肽转化率的影响 在100mL蒸馏水中加入2g豆粕粉，配制成0.02g/mL的豆粕粉溶液，酶解温度保持在55℃，木瓜蛋白酶酶活为35000U/g，保持pH等于6。分别选择酶解时间为4、6、8、10h，考察各组多肽的转化率。

1.2.4 正交实验 在单因素实验基础上，选择单因素最优的条件进行正交实验，优化木瓜蛋白酶酶解黑豆豆粕制备多肽溶液的最佳工艺条件。实验正交分析表见表1。

表1 实验正交分析表Table1 Orthogonal analysis of experiment

2 结果与讨论

2.1 四肽标准曲线

以四肽浓度为横坐标x(mg/mL)，OD值为纵坐标，制作标准曲线，见图1，得回归方程y=0.209x－0.005，R2=0.9991。

2.2 酶活对黑豆多肽转化率的影响

加酶量对黑豆多肽得率的影响如图2所示。由图2可以看出，当加酶量小于35000U/g时，由于酶活没有达到最适值，所以多肽转化率随着加酶量的增加而上升;当加酶量达到35000U/g时，多肽转化率达到最大;当加酶量大于35000U/g时，多肽转化率略有下降。所以当加酶量为35000U/g时，多肽含量最高。

2.3 豆粕粉浓度对多肽转化率的影响

图1 四肽标准曲线Fig.1 Four peptide standard curve

图2 加酶量对黑豆多肽转化率的影响Fig.2 Effect of enzymes content on the yield of black beans peptide

图3 豆粕粉浓度对多肽转化率的影响Fig.3 Effect of soya meal concentration on the yield of peptide conversion

豆粕粉浓度对多肽转化率的影响如图3所示。由图3可以看出，当豆粕粉浓度为0.01g/mL时，多肽转化率最高;随着豆粕粉浓度增大，多肽转化率下降。酶需要在水溶液环境下与特异结合位点发生作用，当豆粕粉浓度增大时，豆粕含量增加，影响了水溶液的浓度，蛋白分子容易聚集，使酶不能很好酶解蛋白分子，所以当豆粕粉浓度升高时，肽转化率反而下降。

2.4 酶解温度对多肽转化率的影响

酶解温度对多肽转化率的影响如图4所示。由图4可以看出，当酶解温度小于55℃时，多肽转化率随着温度的上升而增大;当酶解温度为55℃时，多肽转化率达到最大;当酶解温度大于55℃时，多肽转化率随着温度上升而略有下降。酶作用于底物时需要一定的温度，当小于或大于这个温度时酶都不能达到最大的酶活力，木瓜蛋白酶的最适温度为55℃，所以在最适温度下多肽转化率最高。

2.5 酶解时间对多肽转化率的影响

图4 酶解温度对多肽转化率的影响Fig.4 Effect of temperature on the yield of the peptide conversion

酶解时间对多肽转化率的影响如图5所示。由图5可以看出，当酶解时间小于6h时，多肽转化率随着酶解时间的增加而增大;当酶解时间为6h时，多肽转化率达到最大;当酶解时间大于6h时，多肽转化率下降。木瓜蛋白酶酶解黑豆豆粕粉成短链的多肽，随着酶解时间的增加，当酶解时间小于6h时，蛋白质被酶解成多肽，所以多肽含量上升。但是随着时间的继续增长，酶解时间大于6h，多肽又被木瓜蛋白酶酶解成氨基酸，所以多肽含量有所下降。

图5 酶解时间对多肽转化率的影响Fig.5 Effect of time on the yield of peptide conversion

2.6 制备黑豆多肽条件的优化

制备黑豆多肽正交实验结果分析见表2。由表2可以看出，各因素对黑豆多肽制备的影响顺序由大到小为:温度＞时间＞豆粕粉浓度＞加酶量。各因素的优组合为豆粕粉浓度为0.01g/mL，温度为60℃，加酶量为40000U/g，酶解时间为7h。

最优实验的验证实验结果，平均多肽转化率为63.53%，高于正交实验中各组实验结果。因此证明木瓜蛋白酶酶解黑豆豆粕粉的最佳条件为豆粕粉浓度0.01g/mL，温度为60℃，加酶量为40000U/g，酶解时间为7h时，多肽转化率为63.53%。

3 结论

在本实验所涉及的因素水平范围内，以多肽转化率为考察指标，在单因素实验的基础上采用正交实验分析优化了多肽的提取工艺，从而得到了木瓜蛋白酶酶解黑豆豆粕粉的最佳工艺条件为豆粕粉浓度为:0.01g/mL，温度为60℃，加酶量为40000U/g，酶解时间为7h时。各因素对其影响顺序为:温度＞时间＞豆粕粉浓度＞加酶量。在最佳工艺条件下，多肽转化率为63.53%。实验提取条件简单、易行、经济，适合工厂大规模生产，过程易于控制，具有良好的开发和利用前景。

表2 实验结果正交分析表Table2 Orthogonal analysis of experiment results

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