新生脉散片的提取工艺研究*

刘建海，崔维利，陈 涛，孟 萌

300193 天津中医药大学第一附属医院（崔维利，陈 涛，孟 萌）

新生脉散片具有益气、活血、利水的功效，临床用于治疗气虚血瘀水停证。全方由刺五加、黄芪、党参、丹参等9味中药材组成，方中君药刺五加，功能益气健脾，补肾安神，主含紫丁香苷等成分；黄芪功能补气固表，利尿托毒，主含黄芪甲苷等成分[1]。为保证药物疗效和有效成分的提取效果，实验中参考有关文献[2-9]，采用正交实验法，以紫丁香苷含量和黄芪甲苷含量为考察指标进行综合评价，优选新生脉散片的提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司，配备Waters ACQUITY PDA二极管阵列检测器，四元溶剂管理器，自动进样恒温管理器，EmpowerⅢ色谱工作站）；Waters 600E HPLC高效液相色谱仪（美国Waters公司，配备Waters 2420蒸发光散射检测器，Waters 600E四元高压泵，Waters In-Line脱气机，EmpowerⅡ色谱工作站）；AG135电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DZKW-S-6型电热恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）。

1.2 试药 紫丁香苷对照品（批号111574-200603）、黄芪甲苷对照品（批号110781-200109），均购自中国药品生物制品检定所；方中药材购自安徽亳州药材公司，经鉴定均符合中国药典2010年版一部要求；乙腈（色谱纯，美国Dikma公司）；磷酸（色谱纯，天津科密欧公司）；正丁醇（天津市化学试剂批发公司）；氨水（天津市化学试剂批发公司）；水为自制超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计 根据文献资料及预实验结果，影响有效成分提取效果的主要因素为加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）。实验中对上述每个因素设计3个水平，采用L9（34）正交实验表，对新生脉散片的提取工艺进行优选，因素水平见表1。

表1 因素与水平

2.2 考察指标及评分方法 采用紫丁香苷含量和黄芪甲苷含量为考察指标，各占50%加权计算综合评分，对新生脉散片的提取工艺进行综合评价。按下式计算综合评分。综合评分＝（紫丁香苷含量／最大紫丁香苷含量）×50%×100＋（黄芪甲苷含量／最大黄芪甲苷含量）×50%×100。

2.3 紫丁香苷的含量测定

2.3.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEN C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-水-磷酸（5∶95∶0.4）；流速：0.2 mL/min；进样量：1 μL；检测波长：265 nm；柱温：30℃。

2.3.2 标准曲线的绘制 精密称取经五氧化二磷减压干燥器中干燥12h的紫丁香苷对照品10.00mg，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得0.200g/L的对照品贮备溶液。分别精密量取对照品贮备溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加甲醇稀释并定容至10 mL，分别精密吸取上述溶液及对照品储备溶液各1μL，依次注入超高效液相色谱仪，按“2.3.1”项色谱条件测定，以峰面积值为纵坐标，对照品的浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y赞=1.43×107X－5.55×104，r＝0.999 8（n＝6）。结果表明，紫丁香苷在 0.020～0.200g/L浓度范围内呈良好的线性关系。

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取紫丁香苷对照品适量，加甲醇溶解并配制成0.080g/L的溶液，过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液。

2.3.4 供试品溶液的制备 取新生脉散片处方中各药材共9份，按正交实验表中的条件，分别加水回流提取，合并水提液，静置，滤过，浓缩至每1 mL相当于1g原生药材的流浸膏，精密量取10 mL，用水饱和的正丁醇提取4次，每次20mL，合并正丁醇液，精密量取正丁醇液40 mL备用，其余正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，过0.22 μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.5 阴性供试品溶液的制备 取处方中除刺五加外其余药物按“2.3.4”项制备方法，制成刺五加阴性供试品溶液。

2.3.6 专属性实验 分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各1 μL，注入超高效液相色谱仪，按“2.3.1”项色谱条件测定，阴性供试品色谱中，在与紫丁香苷对照品峰相应的位置上无干扰峰，结果见图1。

2.3.7 样品含量测定 分别精密吸取“2.3.4”项下制备的供试品溶液各1 μL，依次注入超高效液相色谱仪，按“2.3.1”项色谱条件测定，计算紫丁香苷的含量。

2.4 黄芪甲苷的含量测定

2.4.1 色谱条件 Waters Sunfire TM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流动相：乙腈-水（35∶65）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：35 ℃；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度为65℃，载气压力为35 kPa。

2.4.2 标准曲线的绘制 精密称取黄芪甲苷对照品12.00 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得0.240g/L的对照品贮备溶液。分别精密量取对照品贮备溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加甲醇稀释并定容至10 mL，分别精密吸取上述溶液及对照品储备溶液各10 μL，依次注入高效液相色谱仪，按“2.4.1”项色谱条件测定，以峰面积的对数值为纵坐标，对照品浓度（mg/mL）的对数值为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y赞=1.23X+6.17，r=0.999 7（n＝6）。结果表明，黄芪甲苷在0.024～0.240g/L浓度范围内，对照品浓度的对数值与峰面积的对数值呈良好的线性关系。

2.4.3 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇溶解并配制成0.120g/L的溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液。

2.4.4 供试品溶液的制备 取“2.3.4”项下备用的正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次20 mL，弃去氨试液，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.4.5 阴性供试品溶液的制备 取处方中除黄芪外其余药物按“2.4.4”项制备方法，制成黄芪阴性供试品溶液。

2.4.6 专属性实验 分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.4.1”项色谱条件测定，阴性供试品色谱中，在与黄芪甲苷对照品峰相应的位置上无干扰峰，结果见图2。

图2 黄芪甲苷高效液相色谱图

2.4.7 样品含量测定 分别精密吸取“2.4.4”项下制备的供试品溶液各10 μL，依次注入高效液相色谱仪，按“2.4.1”项色谱条件测定，计算黄芪甲苷的含量。

2.5 干膏率的测定 精密量取水提液50 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，移置干燥器中冷却30 min，取出后迅速称定质量，按下式计算干膏率。干膏率（%）＝（干浸膏质量／药材质量）×100%。

2.6 正交实验结果 以紫丁香苷含量和黄芪甲苷含量为考察指标进行综合评价，正交实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交实验结果

表3 方差分析结果

表2分析结果表明，各因素对紫丁香苷含量和黄芪甲苷提取效果的影响顺序为C>B>A，即提取次数>提取时间>加水量，因此，提取次数在新生脉散片的提取工艺中影响最大。表3分析结果表明，提取次数对提取效果的影响有统计学意义（P＜0.05），提取时间、加水量对提取效果的影响无统计学意义。综合直观分析和方差分析，同时考虑提高效率及节约能源等因素，优选提取工艺的最佳水平为A2B2C3，即：处方药材加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

2.7 验证正交实验 按正交实验确定的最佳工艺条件提取3批样品，分别测定紫丁香苷含量、黄芪甲苷含量、干膏率，结果见表4。

表4 验证实验结果

验证正交实验结果表明，该提取工艺条件稳定可行，重现性好。因此新生脉散片的最佳提取工艺为：处方药材加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

3 讨论

新生脉散具有益气、活血、利水的功效，是中医治疗气虚血瘀水停证的常用方剂，原方以水为溶媒，采用汤剂形式应用于临床疗效显著。新生脉散片是在原方基础上开发的新剂型，在保证原方疗效的同时，又具有服用量小、服用方便、口感改善、便于保存等优点。

刺五加和黄芪均为方中君药，紫丁香苷、黄芪甲苷为方中君药的主要有效成分。因此，为保证全方中主要有效成分的提取效果，以紫丁香苷和黄芪甲苷含量各占50%加权，计算综合评分，作为提取工艺的考察指标；干膏率是确定制剂规格的重要参数，但由于不参与对疗效的贡献，所以在验证正交实验中对其进行考察。

实验中紫丁香苷及黄芪甲苷的供试品溶液制备方法均为液液提取法，该方法可以实现对紫丁香苷及黄芪甲苷的提取，而采用碱性的氨试液洗涤，可以进一步富集黄芪总皂苷，提高黄芪甲苷转化率，最终提高黄芪甲苷含量。所建立的供试品溶液制备方法，在保证提取效果的前提下，简化了操作步骤，便于在实际工作中使用。

实验中采用超高效液相色谱（UPLC）法测定紫丁香苷的含量，UPLC法较高效液相色谱（HPLC）法更加简便快速，能得到更高的分析灵敏度，减少有机溶剂的消耗。采用二极管阵列检测器测定黄芪甲苷的含量时，检测效果不理想；而采用蒸发光散射检测（ELSD）器测定时，对照品峰面积的对数值与浓度的对数值呈良好的线性关系。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（一部）[S].北京：化学工业出版社，2010：192，283.

[2]阎雪梅，贾 凡.扶肾颗粒制备工艺研究[J].天津中医药大学学报，2011，30（4）：234－237.

[3]李 康，李 柯，陈 丹，等.刺蓝抗疲劳口服液提取工艺的研究[J].中国实用医药，2011，6(15)：32-34.

[4]郭美华.刺五加的水提取工艺[J].黑龙江医药，2011，24（1）：90－92.

[5]尹 华，张春霞，章建华,等.芪参健骨颗粒的提取工艺研究[J].中国现代应用药学，2011，28（12）：1106-1109.

[6]贾 媛，恽 菲，常星洁.多指标优选芪葵颗粒提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（20）：27-29.

[7]姜文红，刘 静，仲昭庆，等.HPLC法同时测定刺五加浸膏中 3 种有效成分的含量[J].药物分析杂志，2010，30（6）：1145－1147.

[8]马志平，陈 涛，李 进，等.丹芪偏瘫胶囊中间体的HPLC/DAD/ELSD指纹图谱研究[J].天津中医药大学学报，2009，28（4）：198-200.

[9]张新建，郭美华，刘世萍.高效液相色谱—蒸发光散射检测器测定安神益心液中黄芪甲苷的含量[J].中国药物与临床，2011，11（8）：919－920.