浓缩果汁中甲基硫菌灵、2-氨基苯并咪唑、多菌灵、噻菌灵及5-羟基噻菌灵残留量的液相色谱－串联质谱法测定

刘晓松，郑 玲，黄文雯，卢 炜，宁恩创，方晓明

(1．广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广西 南宁 530021;2．广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004;3．上海出入境检验检疫局 动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135)

苯并咪唑类是高效、广谱的内吸性杀菌剂，对植物病害具有很强的抗菌活性，可用于植物真菌等病虫害的防治［1－2］。常用的苯并咪唑类杀菌剂有苯菌灵、甲基硫菌灵、2-氨基苯并咪唑、噻菌灵和多菌灵，其性质与作用各不相同;其中苯菌灵能防治水果的真菌病害、螨类等，但会引起哺乳动物染色体变化、抵制蛋白合成［3］;多菌灵能有效抑制病原菌的繁殖、生长［4］，但残效期长，易在植物体内富集［5］;甲基硫菌灵对真菌的防治效果显著，广泛应用于重要作物［6］，在植物体内可代谢为多菌灵［7］;噻菌灵主要应用于果蔬的防腐，是一种会使小鼠肾致畸的物质［8］，其代谢产物是5-羟基噻菌灵;2-氨基苯并咪唑具有强杀菌、抗菌能力，但其分子量很低，难以分解及转化，从而对环境造成威胁。基于这些杀菌剂的危害性，美国、日本等国家现已严格控制食品中该类物质的残留量，目前各国对该类杀菌剂在水果和果汁中的最高残留量为0.05～20 mg/kg［9］，我国也已将食品中苯并咪唑类杀菌剂的残留量列为重要监测项目。

目前国内外对该类杀菌剂的检测方法主要有HPLC法［10－14］、LC－MS/MS法［15－16］等。这些方法主要检测水果及水果制品中多种农药的残留，针对浓缩果汁中苯并咪唑类杀菌剂的研究很少。已有方法中针对单一杀菌剂检测的研究多，而多种杀菌剂同时检测的研究较少，几乎没有涉及代谢物检测的研究。为有效监控浓缩果汁的质量安全，便于国内各检验机构的日常检测及各浓缩果汁的产品质量控制，本文建立了一种简单有效、准确可靠且能同时检测甲基硫菌灵、2-氨基苯并咪唑、噻菌灵、多菌灵、5-羟基噻菌灵残留的分析方法。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

苹果、菠萝、荔枝、芒果、橙子、西番莲、梨 7种浓缩果汁;标准品:2-氨基苯并咪唑(Dr.Ehrenstorfer，德国)、多菌灵、噻菌灵、5-羟基噻菌灵、甲基硫菌灵(Sigma－Aldrich，美国)，5种标准品纯度均大于97%;PSA小柱(500 mg/6 mL，CNW Technologies GmbH);乙腈、甲苯、乙酸铵、甲醇、甲酸(HPLC级，TEDIA Company);磷酸氢二钠、氯化钠(AR级，成都市科龙化工试剂厂)。

液相色谱－串联质谱仪(Agilent RRLC1200+Agilent 6410B，美国)，配电喷雾源(ESI);pH计;振荡器;高速离心机(10 000 r/min);真空旋转蒸发仪;Milli-Q超纯水器。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 单标标准溶液的配制:用分析天平分别称取0.010 g的标准品，用甲醇配制成100 mg/L的单标标准溶液，于－18℃下避光保存;混合标准溶液的配制:用5种单标标准溶液，根据实验需要稀释配制成0.2、0.1、0.08、0.04、0.02 mg/L的系列混合标准溶液。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB－C18柱，4.6 mm×50 mm，粒径为1.8 μm(Agilent公司);流动相:0.1%甲酸－10 mmol/L乙酸铵(A)和甲醇(B)梯度洗脱;洗脱程序:编制洗脱曲线，起始状态为90%A，在0～7 min，使A相降至20%，保持2 min后，在1 min内使A相降至0%，保持4 min，之后在1 min内将A相从0%升至90%，保持5 min后恢复起始状态;流速:0.4 mL/min;进样体积:10 μL;柱温:40℃。

1.2.3 质谱条件 离子源:电喷雾离子源ESI;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM);毛细管电压:4 000 V;雾化气温度:350℃;雾化气流量:12 L/min;雾化气压力(氮气):40 psi。

1.2.4 样品提取 称浓缩果汁样品2 g(精确至0.001 g)于50 mL离心管中，加入10 mL至20 mol/L的Na2HPO4缓冲溶液、3 g氯化钠混匀，用2 mol/L的NaOH溶液调pH值至8.5～8.6，加入10 mL乙

腈振荡提取15 min，8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，重复提取操作1次，合并上清液并定容至20 mL。取10 mL上清液至100 mL的鸡心瓶中，40℃真空旋转浓缩至1.5～2 mL，待净化。

1.2.5 净 化 在PSA柱中加入1.0 g(精确至0.01 g)无水硫酸钠，用4 mL乙腈－甲苯溶液(3∶1)活化柱子，待液面到达固体面时，迅速将浓缩液上柱，再用2 mL乙腈－甲苯溶液(3∶1)洗涤鸡心瓶并过柱，重复操作3次。最后用15 mL乙腈－甲苯溶液(3∶1)洗脱，收集全部柱流出液于100 mL鸡心瓶中，旋转蒸发至1.5～2 mL，转移至15 mL的离心管中，并用3 mL乙腈－甲苯溶液(3∶1)洗涤鸡心瓶2次，合并洗涤液至15 mL离心管中，于40℃水浴下用氮气吹至近干。用1 mL流动相定容并超声3～5 min，混匀，过0.22 μm有机相滤膜，LC－MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的确定

分别配制1 mg/L的2-氨基苯并咪唑、5-羟基噻菌灵、多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵标准溶液，选择ESI+电离模式，对雾化气温度、雾化气流量、源内碎裂电压及碰撞能量等条件进行优化。经反复测试、优化，得到5种待测物的质谱条件如表1所示。

表1 5种杀菌剂及代谢物的质谱条件Table 1 MS parameters of 5 pesticides and its metabolites

2.2 样品定容液的选择

样品定容液的组成对各物质在色谱柱中的分离行为和离子化效率即质谱检测的灵敏度有一定的影响。本文分别以纯甲醇、甲醇－水(1∶1)和甲醇－缓冲盐溶液(10 mmol/L乙酸铵－0.1%甲酸，1∶9)作为定容液进行检测。结果显示，随着定容液中甲醇含量的升高，待测物的峰形逐渐展宽，以纯甲醇作为定容体系时，2-氨基苯并咪唑的峰有拖尾现象;以甲醇－缓冲盐溶液(10 mmol/L乙酸铵－0.1%甲酸，1∶9)作为定容液时，各待测物的峰形及分离均较好，响应值满足检测要求。在选定条件下，混合标准溶液的总离子流图及5种杀菌剂及代谢产物的定量离子色谱图如图1所示。

2.3 样品前处理条件的选择

2.3.1 提取条件的选择 据文献［12－13］报道，样品溶液pH值对待测物的提取有较大的影响。将样品溶液的pH值分别调为7.0、8.0、9.0、10.0、12.0，实验显示，当pH值为12.0时，只有多菌灵、噻菌灵出峰;当pH值为10.0时，甲基硫菌灵未出峰;当pH值为7.0、8.0、9.0时，5种待测物均出峰，但pH值7.0时，2-氨基苯并咪唑的提取效果较差;当pH值为8.0、9.0时，5种待测物的提取较好，但各待测物的回收率有差异。进一步将样品溶液的pH值分别调为8.0、8.2、8.4、8.5、8.6、8.8、9.0，结果显示，pH值低于8.5时，2-氨基苯并咪唑的回收率偏低，pH值高于8.6时，甲基硫菌灵的回收率偏低。综合考虑各待测物的回收率，最终确定提取样液的pH值为8.5～8.6。

2.3.2 样品净化条件的确定 比较了MCX柱、NH2柱、C18柱、NH2柱+活性碳柱和PSA柱对样品的净化效果。结果表明，用C18柱净化时5种待测物的回收率均较低，且LC－MS/MS测定时有杂峰干扰;用MCX柱、NH2柱和NH2柱+活性碳柱净化时，2-氨基苯并咪唑的回收率较差;用PSA柱净化时，由于PSA柱的极性比NH2柱弱，对2-氨基苯并咪唑的吸附力相对较弱，使其洗脱效果显著，5种待测物回收率均满足检测要求，且效果稳定，所以净化柱选用PSA柱。

图1 5种杀菌剂及代谢物混合标准溶液的总离子流图及其色谱图Fig.1 TIC spectrum of standard mixture of 5 pesticides and its metabolites and their chromatograms

2.4 线性范围与定量下限

准确称取2 g(精确至0.001 g)样品，按“1.2”方法进行处理，以获得的基质溶液为溶剂，配制质量浓度为0.2、0.1、0.08、0.04、0.02 mg/L的系列标准溶液。在优化条件下进行测定，以质量浓度(x，mg/L)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标进行回归分析，得到各待测物的线性方程和相关系数(见表2)。结果表明各待测物在0.02～0.2 mg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均不小于0.998 5。

表2 5种待测物的线性方程及相关系数Table 2 Calibration curves and correlation coefficients(r)of five analytes

对各种基质的阴性样品进行加标实验，以信噪比(S/N)≥10计算得到2-氨基苯并咪唑和5-羟基噻菌灵的定量下限为2.0 μg/kg，多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵的定量下限为1.0 μg/kg。

2.5 回收率与精密度

在苹果、芒果、菠萝、梨、橙、荔枝、西番莲7种浓缩果汁的阴性样品中分别添加MBC、TBZ、TM为1、2、10 μg/kg，2-AB、5-OH-TBZ为2、4、20 μg/kg 3个不同水平的待测物标准品，每个水平重复测定6次，各待测物的平均回收率在70%～110%之间，相对标准偏差(RSD)为0.1%～10.9%(见表3)。

2.6 实际样品的检测

在市场上随机抽取市售橙子、荔枝、苹果、西番莲、梨汁、菠萝、芒果浓缩果汁样品，按本方法进行检测。检测苹果汁样品7个，其中检出2-氨基苯并咪唑残留量为1.8～25.7 μg/kg，多菌灵1.3～20.2 μg/kg;荔枝汁样品3个，其中检出多菌灵残留量为1.3～20.2 μg/kg;菠萝汁样品3个，其中检出2-氨基苯并咪唑残留1.1 μg/kg，多菌灵残留1.0～1.4 μg/kg;橙子汁样品1个，检出多菌灵残留1.2 μg/kg。以上所检出的残留量，均远低于国际组织及我国规定的最大残留限量值，证明本方法灵敏、高效，可用于国内各检验机构的日常检测及各浓缩果汁生产厂的产品质量控制。

表3 7种浓缩果汁样品的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of five target compounds in seven kinds of concentrated fruit juice(n=6)

3 结论

本文建立了一种能同时检测浓缩果汁中甲基硫菌灵、2-氨基苯并咪唑、噻菌灵、多菌灵、5-羟基噻菌灵残留的液相色谱－串联质谱法。方法的回收率在70%～110%之间，相对标准偏差在0.1%～10.9%之间，2-氨基苯并咪唑和5-羟基噻菌灵的定量下限为2.0 μg/kg，多菌灵、噻菌灵、甲基硫菌灵的定量下限均为1.0 μg/kg。实际样品测试表明:该方法能有效检测出浓缩果汁中5种杀菌剂及其代谢物的残留量，方法具有灵敏、稳定、可靠的特点，为监控我国浓缩果汁的质量安全提供了一个行之有效的途径。

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