藜豆种质资源遗传多样性的ISSR分子标记分析

张凤银，戴希刚，潘 磊

（江汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430056）

藜豆种质资源遗传多样性的ISSR分子标记分析

张凤银，戴希刚，潘 磊

（江汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430056）

利用ISSR标记构建了9份藜豆种质的指纹图谱，并对其遗传多样性进行评价。结果表明，从35条引物中筛选出8条重复性好的多态性引物进行PCR扩增，共扩增出64条带，其中多态性条带50条，多态性比例为78.1%。应用其中3条多态性ISSR引物（UBC889、UBC812、UBC825）的12条特异性条带，可以有效区分供试的9份藜豆种质资源。藜豆种质间的遗传相似系数变化范围在0.47～0.97之间。利用UPGMA聚类分析，在相似性系数为0.73处可将9个藜豆种质资源划分为3个类群，其亲缘关系与种质地理来源之间存在一定关联性。

藜豆；种质资源；遗传多样性；ISSR；相似系数；聚类分析

藜 豆（Stizolobium cochinchinensis）（2X=2N=22），别名猫豆、狗爪豆等，属豆科藜豆属一年生草质藤本植物，具有食用［1］、药用［2］、家畜饲料［2］等多种用途。该种原产于热带及亚热带地区，在我国的分布区域包括广东、海南、广西、四川、贵州、湖北和台湾等省区。前人对藜豆的研究主要集中在栽培生理及左旋多巴含量、提取方法等方面［3-4］，而对其遗传多样性方面的研究鲜见报道。

分子标记是分析种质遗传多样性的有效手段［5-7］，与形态学、细胞学和蛋白质标记相比较，分子标记直接以核酸作为研究对象，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测，不受发育阶段、环境限制，方法可靠，揭示多态性水平高［8］。ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，简单重复序列区间）是1994年由加拿大蒙特利尔大学的Ziet⁃kiewicz等［9］在微卫星分子标记基础上发展起来的一种分子标记技术，结合了RADP和SSR的优点，具有多态性高、重复性好、显性标记、成本较低、模板用量少等特点。目前，该技术广泛应用于农作物［10］、蔬菜［11］、果树［12］、牧草［13］等植物的遗传多样性、亲缘关系、遗传作图、基因定位等方面的研究。

本研究利用ISSR标记对9份藜豆种质资源进行遗传多样性分析，对相应资源建立特异性的指纹图谱，以期为科学合理地保护和利用藜豆种质资源提供理论依据和技术支持，为利用分子标记辅助育种手段培育藜豆新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

9份 藜 豆 种 质 资 源 LD-1、LD-2、LD-3、LD-4、LD-5、LD-6、LD-7、LD-8、LD-9（分别记为1、2、3、4、5、6、7、8、9）作为本研究的试验材料，其来源及主要性状列于表1。对9份藜豆种质资源进行穴盘育苗，待幼苗长至2片真叶时，每份材料随即选取5株取其嫩叶备用。

1.2 DNA提取

采用改良的CTAB法［14］提取藜豆基因组DNA。经2%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其质量和浓度后，置于-70℃冰箱保存备用。

1.3 PCR扩增及检测

根据加拿大哥伦比亚大学公布的ISSR引物序列，由金斯瑞生物科技有限公司合成。利用优化的PCR反应体系从35条ISSR引物中筛选出扩增条带清晰、多态性强和重复性好的8条ISSR引物（表2）。基于8条多态性ISSR引物分别对9份藜豆材料进行PCR扩增。25 μL反应体系中各反应物含量为：20 ng模板DNA，2μL 10×Buffer，1U Taq DNA聚合酶，0.4 μM 引物，0.20 mM dNTPs.PCR扩增在 PTC-100TM（Bio-Rad，USA）PCR仪上进行，采用touchdown扩增程序：94℃预变性5 min，然后进行下列循环：94℃变性30 s，最佳退火温度下复性30 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后于72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物采用2.0%琼脂糖凝胶电泳（TBE电泳缓冲液，0.5 μg/L EB）检测，在80 V恒压下电泳约1 h，用DL2000 DNA Marker（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作分子量标准，在凝胶成像系统仪中拍照记录电泳图谱。

表1 供试藜豆种质材料来源及其主要性状

表2 ISSR引物序列及多态性分析

1.4 数据处理与指标计算

选取清晰ISSR电泳图谱，采用0/1赋值记带，有带的记为1，无带或弥散的条带记为0，汇总建立0/1矩阵数据库。利用NTSYS-pc 2.10软件统计ISSR数据的遗传相似系数（GS），用UPMGA法进行聚类分析并绘出聚类图。

2 结果与分析

2.1 藜豆种质资源ISSR遗传多样性分析

从35条ISSR引物中筛选出能够产生稳定、清晰多态性扩增条带的8条引物进行分析（表2），PCR扩增结果见图1。基于这8条多态性ISSR引物在9份藜豆资源材料中共扩增出64个条带，平均每条引物扩增的条带数为8条，其中引物UBC889扩增的条带数最多，为12条，而引物UBC808扩增的条带数最少，只有4条。在所获得的64个条带中多态性条带有50条，其多态性比率为78.1%，其中引物UBC825的多态性比率最高为100%，而引物UBC808的多态比率最低，仅有50%。

2.2 供试种质的指纹图谱

电泳结果表明，不同ISSR引物在供试的9份藜豆种质资源之间检测到不同的分子指纹图谱。其中，3条多态性ISSR引物（UBC889、UBC812、UBC825）能有效区分不同基因型。UBC889引物检测到的多态性条带中有4个条带（560，750，1 500，1 800 bp）能区分 LD-4、LD-5、LD-6和LD-8（图1），因为750 bp条带为LD-4所特有，LD-5缺失560 bp条带，LD-6有560 bp条带，而无750 bp条带，LD-8同时缺失1 500 bp和1 800 bp条带。UBC812引物检测到的多态性条带中有3个条带（580，660，1 600 bp）能区分LD-1、LD-2和LD-4（图2）。在LD-1和LD-2均有1 600 bp条带，而其他7份样品则没有此带，在LD-4中同时缺580 bp和660 bp条带。UBC825引物检测到的多态性条带中有5个条带（250，570，625，1 900，2 000 bp）能区分 LD-1、LD-3、LD-7和LD-8（图3）。LD-1中无570 bp条带，LD-3中同时缺失1 900 bp和2 000 bp条带。LD-7中缺失同时缺失250 bp和570 bp条带，而LD-8中同时缺失570 bp和625 bp条带。因此，综合运用上述3条多态性ISSR引物检测到的12条特异性条带，可以有效区分供试的9份藜豆种质资源。

2.3 遗传相似性与聚类分析

供试材料间的遗传相似系数（GS）见表3。通过遗传相似系数计算出遗传距离（GD=1-GS）。遗传相似系数大，遗传距离短，表明种质之间的亲缘关系近，反之，亲缘关系远。9个藜豆种质资源之间的相似系数范围为0.47～0.97。其中同来自广西东兰县的主栽品种花籽藜豆LD-1和灰籽藜豆LD-2的相似系数最大，为0.97，遗传距离最短，亲缘关系最近。来自四川的黑籽白花藜豆的LD-5和来自广东的花籽紫花藜豆LD-9的遗传相似系数次之，为0.91。而同来自广西东兰县的LD-2和LD-8之间的相似系数最小，为0.47，遗传距离最远，亲缘关系最远。

图1 引物UBC889的ISSR扩增图谱

图2 引物UBC812的ISSR扩增图谱

图3 引物UBC825的ISSR扩增图谱

系统聚类图（图4）可以直接反映9份种质的亲缘关系，聚类图显示，若以相似系数0.73为阈值，可将9份藜豆种质资源划分为3类。第1类包括 LD-1、LD-2、LD-3；第 2类包括 LD-4、LD-5、LD-6、LD-7、LD-9；第 3类包括 LD-8。从聚类结果来看，9份藜豆材料分为3大类，但并非来自同一地区的种质归为同一类，如LD-1、LD-2、LD-3、LD-4、LD-8均来自广西，前3种归为1类，而后两者分别归为另2类。说明聚类的结果与地理来源有一定相关性，但并不密切，这说明藜豆种质资源有较高的遗传变异性，存在着较大的选育潜力。

表3 藜豆种质的遗传相似系数矩阵

图4 藜豆种质资源的聚类分析图

3 讨论

由于ISSR标记具有信息量丰富、操作简单、重复性好、稳定性强等诸多优点，因而被广泛应用于植物遗传多样性的研究中。曾亮等［15］利用ISSR标记技术对来自国内外的73份豌豆材料进行遗传多样性分析，发现11条有效引物共扩增出91个位点，其中多态性位点78个，多态性比率为86.4%，聚类结果显示，来源相近的材料聚为1类，呈现出一定的地域性分布规律。高山等［16］采用ISSR标记技术对源自中国7个省份的38份瓠瓜（Lagenaria sicerari）种质进行遗传多样性分析，12个ISSR引物共扩增出96条多态性带，多态性比率平均为83.5%，聚类结果与瓠瓜的农艺性状分类和地理分布有一定的相关性。本研究也得出相似的结果。在本研究中，对9份藜豆种质资源进行ISSR分子标记，发现对8条重复性好的多态性引物进行PCR扩增，共扩增出64条带，其中多态性条带50条，多态性比例为78.1%，这表明藜豆种质资源具有遗传多样性。从聚类图可以看出，在相似系数约为0.73处，将9份材料聚为3类，聚类基本符合地理来源相近的品种聚为1类。但也有相同地理来源的品种未归为1类，如 LD-1、LD-2、LD-3、LD-4、LD-8均来自广西，前3种归为1类，而后两者分别归为另2类。产生这种结果的原因可能有2个方面：

1）地理来源相同的材料虽来自同一环境，但由于选择方向的不同和选用育种材料的错综复杂，也可能形成遗传差异较大的类型，因此出现地理来源相同的品种被归入不同类群；

2）受环境饰变作用的影响，物种在长期适应环境的过程中会出现某些性状趋同的现象，造成不同物种性状间的交叉。

致谢：华中农业大学食品科学学院熊善柏教授及广西农科院陈彩虹研究员、高国庆研究员在收集藜豆种质资源时给予了大力帮助，谨致谢意。

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Genetic Diversity Analysis of Velvet Bean Germplasm Resources with ISSR Markers

ZHANG Feng-yin，DAI Xi-gang，PAN Lei
（School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Constructed the fingerprint of 9 velvet bean（Stizolobium cochinchinensis）germ⁃plasm resources and analyse their genetic diversity with ISSR markers.The results indicated that 8 primers with strong stability and repeatability were screened from 35 primers and carried out PCR amplification.64 bands were amplified from 9 velvet bean varieties，among which 50 were polymor⁃phic，and the polymorphic rate was up to 78.1%.Using 12 specific bands in the 3 polymorphic ISSR primers（UBC889、UBC812、UBC825），the 9 velvet bean germplasm resources could be differentiat⁃ed.The genetic similarity coefficients of velvet bean germplasm ranged from 0.47 to 0.97.Nine vel⁃vet bean varieties were divided into 3 groups by UPGMA cluster analysis with the similarity coeffi⁃cient of 0.73.The phylogenetic relationship of velvet beans are partly related to the geological sourc⁃es of the germplasm.

velvet bean；germplasm resources；genetic diversity；ISSR；similarity coeffi⁃cient；cluster analysis

S643.9

：A

：1673-0143（2013）06-0100-05

（责任编辑：陈 旷）

2013－09－22

湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心开放基金项目（2012-01）；武汉市科技攻关计划项目（201120822281）；武汉市科技攻关计划项目（2013021001010478）

张凤银（1964—），女，副教授，研究方向：园艺植物遗传育种。