依托咪酯对腹外侧视前区神经元GABA能传递的抑制作用

刘宇炜，黄 丹，陈晓青，许晓利，李长雷，艾永循

（江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056）

依托咪酯对腹外侧视前区神经元GABA能传递的抑制作用

刘宇炜，黄 丹，陈晓青，许晓利，李长雷，艾永循

（江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056）

目的：研究依托咪酯对大鼠腹外侧视前区神经元γ-氨基丁酸能传递的影响。方法：大鼠腹外侧视前区切片，全细胞膜片钳记录神经元抑制性突触后电流。结果：依托咪酯（0.1 μmol/L）可逆性地降低腹外侧视前区神经元的诱发抑制性突触后电流幅度，但未能显著性改变其配对脉冲比率。依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下，自发抑制性突触后电流的频率与幅度均显著性下降，其动力学参数未受影响。结论：依托咪酯可作用于突触前及突触后γ-氨基丁酸受体而抑制对腹外侧视前区神经元的γ-氨基丁酸能传递，这一作用可能使其处于兴奋状态，进而抑制结节乳头体核的组胺能神经元，减少组胺释放而发挥麻醉镇静作用。

依托咪酯；腹外侧视前区；抑制性突触后电流

睡眠和觉醒是人类的基本行为，其他如社会行为、饮食行为、性行为等与之密切相关。睡眠-觉醒周期乃机体生命之高级生理活动，是一个涉及多系统、多中枢的生理过程，具有复杂的神经调节机制。下丘脑腹外侧视前区（ventrolat⁃eral preoptic area，VLPO）的神经元具有非常重要的促进睡眠作用［1］。腹外侧视前区存在着两类主要的神经元，它们对去甲肾上腺素（noradrena⁃line，NA）的反应截然相反。大多数（约68%）为去甲肾上腺素所抑制［NA（-）］，而少部分为去甲肾上腺素所兴奋［NA（+）］［2］。NA（-）神经元为含有γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的长投射到结节乳头体核（tuberomamillary nucleus，TMN）的睡眠促进细胞，亦即文献通常所指的腹外侧视前区神经元；NA（+）神经元可释放GABA而抑制NA（-）神经元的活动，属该区局部神经元［2-3］。

依托咪酯（etomidate）是一种咪唑衍生类药物，因其具有良好的血液动力学特性，被广泛用于临床快速诱导麻醉［4］。作为一种静脉麻醉剂，依托咪酯的作用主要为增强GABA递质传递，延长其突触抑制作用时间［5］，但其对腹外侧视前区神经元的具体作用机制尚未明了。

在本实验中，笔者采用全细胞膜片钳技术，证明腹外侧视前区GABA能神经元突触前后均存在有功能性的GABAA受体，通过激活这些受体，依托咪酯可能通过抑制对这些神经元的GABA能传递而使处于兴奋状态，进而抑制结节乳头体核的组胺能神经元而发挥麻醉镇静效应。

1 材料与方法

1.1 材料

Sprague-Dawley大鼠，鼠龄20～30天，雌雄不限，由江汉大学医学院医学实验动物中心提供。

依托咪酯（etomidate），谷氨酸受体亚型拮抗剂（AP5和DNQX），γ-氨基丁酸A型受体阻断剂（gabazine）和去甲肾上腺素（noradrenaline）购自Sigma公司，其余试剂为国产分析纯。

孵育液（mmol/L）：glycerol 250，KCl 1.6，NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，调pH值至7.3。

人工脑脊液（ACSF）（mmol/L）：NaCl 125，KCl 1.6，NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，调pH值至7.3。

电极内液（mmol/L）：CsF 135，KCl 5，MgCl22，Hepes 10，Mg ATP 2，GTP 0.2，调pH值至7.2。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腹外侧视前区脑片的制备 参照笔者以前的实验方法［3］，并在此基础上稍加改进：无菌条件下迅速将大鼠断头取脑，置于混合气（95%O2/5%CO2）饱和的冰冷（0～4℃）孵育液中约5 min。在0℃通混合气条件下，采用振动切片机（VF-300，美国Precisionary公司）将腹外侧视前区脑组织切成250 μm厚的冠状切片，置于混合气饱和的孵育液中，室温（22～24℃）下孵育至少1 h以上。

1.2.2 电生理记录 玻璃微电极由P-97电极拉制仪（美国Sutter公司）分两步拉制，充灌电极内液后阻抗为4～6 MΩ。将脑片置于操作台正中约0.4 mL凹槽内，用一铂金环压住。BX51正置显微镜（日本奥林巴斯公司）下选大鼠腹外侧视前区神经元。全细胞膜片钳记录所用仪器为Axo⁃patch 700B膜片钳放大器（美国Molecular公司），在电极与细胞膜之间形成高阻（1～5 GΩ）封接后，进一步将膜吸穿，调节电容和串联电阻补偿。数据以5 kHz过滤，使用Axonscope 1.1.1 acquisition软件通过Axon DigiData-1440A记录于电脑上。整个记录过程中采用混合气饱和的人工脑脊液持续灌流，灌流速度约2 mL/min。

1.2.3 统计学分析 采用Sigmaplot 11.0（Jandel Scientific）和SPSS 16.0进行处理、统计分析和制图。实验结果以均值±标准误（mean±SEM）表示，统计结果采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 依托咪酯对腹外侧视前区神经元诱发抑制性突触后电流的抑制作用

笔者以前的研究表明，NA（-）神经元形状多为三角或多角形，短暂（30 s）给予去甲肾上腺素（100 μmol/L）后可引起超极化，并且神经元还具有低阈值放电（low-threshold spike，LTS）的特性［3］，这和有关报道是一致的［2］。本次实验选用的神经元均为NA（-）神经元。在AP5（50 μmol/L）和二硝基喹酮（6，7-Dinitro-1，4-dihydro-quinoxa⁃line-2，3-dione，DNQX，20 μmol/L）存在条件下，膜电位（VH）钳制于0 mV时，通过刺激电极可激活诱发抑制性突触后电流（eIPSCs），这些电流可被γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体阻断剂gabazine（10 μmol/L，未作图示）完全阻断，证明其为GABAA受体所介导。如图1A所示，通过配对电刺激（刺激间距50 ms）诱发出成对的抑制性突触后电流。依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下第一个诱发抑制性突触后电流幅度减小了（51.7±4.8）%（从（53±10）pA到（22±6）pA，n=8；P＜0.01，图1A和图1B（a）），但未引起配对脉冲比率（paired-pulse ratio，PPR=IPSC2/IPSC1）发生显著性改变（从（1.1±0.1）到（1.0±0.1），n=8；P＞0.05，图1A和图1B（b）），发这一结果证明依托咪酯可减少突触后GABAA释放。

图1 依托咪酯抑制腹外侧视前区神经元诱发抑制性突触后电流

2.2 依托咪酯对腹外侧视前区神经元自发抑制性突触后电流的抑制作用

进一步研究依托咪酯对腹外侧视前区神经元自发抑制性突触后电流（sIPSCs）的影响。在AP5（50 μmol/L）和DNQX（20 μmol/L）存在条件下，膜电位（VH）钳制于0 mV时，自发抑制性突触后电流可被gabazine（10 μmol/L，未作图示）所完全阻断，证明其为GABAA受体所介导。如图2A所示，依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下使自发抑制性突触后电流频率下降了（38.4±3.3）%（从（1.3± 0.5）Hz到（0.8±0.2）Hz，n=7；P＜0.01），这一作用为可逆性的，在正常人工脑脊液冲洗之后，电流频率恢复到对照组的（99.4±2.8）%（n=7；P＞0.05）。第二次给予依托咪酯（0.1 μmol/L）后，自发抑制性突触后电流频率又下降了（39.9± 3.7）%，其下降幅度与第一次给药间差异无统计学意义（n=7；P＞0.05），并且其频率在正常人工脑脊液冲洗后及时恢复。同时，在依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下，自发抑制性突触后电流（sIPSCs）幅度也降低了（10.3±0.8）%（从（17.8± 1.9）pA到（16.2±1.8）pA，n=7；P＜0.05，图2B），而其动力学参数并未改变（图2B右）。

如图2C所示，依托咪酯（0.1 μmol/L）的作用效果进一步为累积概率图所显示，其作用显著延长了连续的自发抑制性突触后电流之间的释放间隔（K-S检验，P＜0.01），同时明显减小电流幅度（K-S检验，P＜0.05）。

图2 依托咪酯抑制腹外侧视前区神经元自发抑制性突触后电流

3 讨论

依托咪酯是临床上最常用的静脉麻醉药，由于它具有起效快、苏醒迅速、对循环、呼吸系统影响较轻等优点，因此被广泛用于全身麻醉的诱导和维持中。依托咪酯主要通过调节GABAA受体氯离子通道产生麻醉作用，它能够增强GABAA受体的效能以及与配体结合的能力，间接抑制中枢兴奋性递质的传递［5-6］。

下丘脑腹外侧视前区与睡眠调节密切相关。最近有报道指出腹外侧视前核损毁前后给予依托咪酯，通过记录脑电图与心电图，分析睡眠、觉醒时相变化及Fos基因在腹外侧视前核的表达变化，认为依托咪酯可经腹外侧视前核的γ-氨基丁酸能神经元通路产生促眠作用［7］。

本研究的全细胞膜片钳表明，作用于腹外侧视前区脑片时，依托咪酯（0.1 μmol/L）可逆性地降低腹外侧视前区神经元诱发抑制性突触后电流幅度，但未引起配对脉冲比率显著性改变，这一结果表明依托咪酯可减少突触后GABA释放。接下来，在依托咪酯（0.1 μmol/L）作用下，sIPSCs的频率与幅度均显著性下降，其动力学参数未受影响，表明依托咪酯可作用突触前及突触后GABA受体而抑制对腹外侧视前区神经元的GABA能传递。

腹外侧视前区的GABA能神经元与结节乳头体核的组胺能神经元之间的交互抑制在睡眠-觉醒转换过程中起着最核心的调节作用。在睡眠过程中，腹外侧视前区神经元快速放电，通过释放GABA（以及galanin）抑制结节乳头体核，引起自身去抑制，放电进一步增加；反过来，在觉醒状态下，结节乳头体核组胺能神经元放电增加，以释放组胺（histamine）为主、同时还释放少量GA⁃BA到腹外侧视前区神经元，可产生抑制作用，进而去抑制结节乳头体核神经元，使其放电活动更为增强［8］。

综上所述，依托咪酯可作用于GABA受体而抑制对腹外侧视前区神经元的GABA能传递，这一作用可能使其处于兴奋状态，进而抑制结节乳头体核的组胺能神经元，减少组胺释放而发挥麻醉作用。这很可能是依托咪酯产生麻醉镇静效果的重要作用机制之一。

［1］ Nelson L E，Guo T Z，Lu J，et al.The sedative compo⁃nent of anesthesia is mediated by GABA（A）receptors in an endogenous sleep pathway［J］.Nature neurosci⁃ence，2002，5（10）：979-984.

［2］ Gallopin T，Fort P，Eggermann E，et al.Identification of sleep-promoting neurons in vitro［J］.Nature，2000，404（6781）：992-995.

［3］ Liu Y W，Li J，Ye J H.Histamine regulates activities of neurons in the ventrolateral preoptic nucleus［J］.J Physiol，2010，588（Pt 21）：4103-4116.

［4］ Chan C M，Mitchell A L，Shorr A F.Etomidate is asso⁃ciated with mortality and adrenal insufficiency in sep⁃sis：A meta-analysis［J］.Crit Care Med，2012，［Epub ahead］.

［5］ Garcia P S，Kolesky S E，Jenkins A.General Anesthet⁃ ic Actions on GABAA Receptors［J］.Curr Neurophar⁃macol，2010，8（1）：2-9.

［6］ Vanlersberghe C，Camu F.Etomidate and other non-barbiturates［J］.Handb Exp Pharmacol，2008，（182）：267-282.

［7］ 张敏，范坤，邵玉峰，等.依托咪酯经腹外侧视前核γ-氨基丁酸能神经元产生促眠作用［J］.兰州大学学报：医学版，2011，37（1）：1-5，10.

［8］ Saper C B，Scammell T E，Lu J.Hypothalamic regula⁃tion of sleep and circadian rhythms［J］.Nature，2005，437（7063）：1257-1263.

Etomidate Inhibits GABAergic Transmission in Neurons in Ventrolateral Preoptic Area

LIU Yu-wei，HUANG Dan，CHEN Xiao-qing，XV Xiao-li，LI Chang-lei，AI Yong-xun
（School of Medicine，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Objective：To study the effect of etomidate on GABAergic transmission in neurons of rat ventrolateral preoptic（VLPO）area.Methods：Rat ventrolateral preoptic area slices were pre⁃pared.Inhibitory postsynaptic current（IPSC）were investigated using whole-cell patch-clamp re⁃cording in VLPO neurons.Results：Etomidate（0.1 μmol/L）reversibly decreased the amplitude of evoked IPSC in VLPO neurons，without changing its paired-pulse ratio（PPR）.Etomidate（0.1 μmol/L）decreased the frequency and amplitude of spontaneous IPSC，did not induce appreciable change in the kinetics of the spontaneous IPSC.Conclusion：Etomidate may act presynaptically and postsynaptically to suppress GABAergic transmission to VLPO neurons，this effect may excite these neurons，lead to the inhibition of histaminergic neurons in tuberomamillary nucleus，which will de⁃crease releasing of histamine and result in anesthesia and sedation.

etomidate；ventrolateral preoptic（VLPO）area；inhibitory postsynaptic current（IPSC）

R338.2-33

：A

：1673-0143（2013）01-0076-04

（责任编辑：范建凤）

2012－10－08

湖北省自然科学基金重点项目（2008CDA053）；武汉市科技计划项目（201250499145-27）

刘宇炜（1973—），男，副教授，博士，研究方向：神经生物学。