复方阿胶浆对小鼠lewis 肺癌CyclinD1、CD44 表达的影响

孙叙敏 陈信义

(1 煤炭总医院中医科，北京，100028;2 北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京，100700)

研究发现，周期素D1(Cyclin D1)的过度表达在许多恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用［1－5］，下调Cyclin D1的表达进而影响肿瘤细胞G1/S的过渡在一定程度上可以抑制增殖，延缓进展［6－7］，并增强肿瘤细胞对药物的敏感性［8］。CD44 属于黏附分子家族成员之一，目前研究主要致力于CD44 与恶性肿瘤临床病理特点的关系上，研究结果尚不统一［9］，多数研究认为CD44的过度表达参与了恶性肿瘤的发生、转移，推测其可能成为恶性肿瘤的不良预后因子。本研究采用免疫组化技术，集中观察经典古方宋“两仪膏”改制成的复方制剂复方阿胶浆对Cyclin D1、CD44 表达的影响，古方新用，从抗肿瘤机制方面探索复方阿胶浆的临床应用。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性C57BL/6 小鼠108只，清洁级，体重15～18 g，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心［许可证号:SCXK(军)2007－004］，于中国医学科学院肿瘤研究所SPF 级动物室饲养。Lewis 肺癌(Lewis Lung carcinoma LLC)瘤源由中国医学科学院肿瘤研究所提供。复方阿胶浆(阿胶、党参、人参、熟地黄、山楂)，20 mL/支，山东东阿阿胶股份有限公司制备并提供(批号:091146);注射用环磷酰胺(CTX)，200 mg/支，山西普德药业有限公司，国药准字H14023686。兔抗CD44(批号:BA0321)一抗、兔链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶(SP)试剂盒SP900l、DAB 显色剂(批号:AR1022)均购自武汉博士德公司、兔抗CyclinD1(批号:bs－0623R)一抗购自北京博奥森生物技术有限公司。Olympus 公司IMT－2 倒置显微镜;美国Diagnostic Instrument Inc Spot－II 数码成像系统。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组 荷lewis 肺癌的C57BL/6 小鼠脱颈处死，完整剥离瘤块，以生理盐水研磨，调细胞密度约2×107/mL(台盼蓝计数活细胞＞90%)，每只小鼠右腋皮下接种0.2 mL。接种后第3日，按体重随机分为6组，分别为模型对照组、CTX组、复方阿胶浆组(中剂量)、复方阿胶浆(大、中、小剂量)联合CTX组，每组10只，称体重并编号［10］。

1.2.2 给药方法 模型对照组予生理盐水0.4 mL，连续灌胃12 d;CTX组，隔日腹腔注射0.2 mL，共给药6 d(CTX 给药剂量为35 mg/kg);复方阿胶浆组(即中剂量组)，予复方阿胶浆原液0.2 mL +生理盐水0.2 mL 灌胃12 d;复方阿胶浆大、中、小剂量联合CTX组分别予复方阿胶浆原液0.4 mL、复方阿胶浆原液0.2 mL+生理盐水0.2 mL、复方阿胶浆0.1 mL +生理盐水0.3 mL 灌胃12 d(复方阿胶浆临床常规用量为60 mL/d，即每20 mL 该液体中含阿胶3 g)，其中CTX 给药方式及剂量同CTX组。以上给药剂量均按照人鼠体表面积折算，复方阿胶浆中剂量为成人剂量的9 倍。

1.2.3 观察指标 1)移植瘤CyclinD1、CD44 免疫组化检测:末次给药24 h 后处死小鼠，取各组肿瘤组织标本，用10 %甲醛在4℃下固定48 h，经脱水、透明、浸蜡及包埋制成蜡块。每组选8个蜡块，按5μm 厚度连续切片，固定于防脱玻片。染色步骤参照SP 法试剂盒，CyclinD1的稀释浓度为1∶20;CD44的稀释浓度为1∶25。以PBS 代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性切片为阳性对照。在光镜下观察阳性反应呈团块状或灶状的棕黄色或褐色。封片后以美国Diagnostic Instrument Inc Spot－Ⅱ数码成相系统拍照，观察蛋白表达。以Universal Imaging Corporation Meta Morph分析系统对结果进行半定量分析，每张片子取5个视野，在400(40×10)倍显微镜下，设置统一阈值分析阳性信号的平均光密度(AOD)，以5个视野的平均值作为该片的数据。2)观察生存期:同期饲养48只C57BL/6 荷lewis 肺癌小鼠，每组8只，观察2个月，造模、分组及给药方法同上。以此来大体判断给药各组的预后情况。

2 结果

2.1 对瘤组织Cyclin D1、CD44 表达的影响及两指标之间相关性

2.1.1 各组对瘤组织Cyclin D1 表达的影响 复方阿胶浆组、复方阿胶浆大剂量联合CTX组能明显下调CyclinD1的表达水平，AOD值分别为(0.213 3±0.020 4)、(0.223 0±0.020 1)，与模型组比较(0.260 9±0.027 2)，有统计学意义(P＜0.05);联合用药各组与单用CTX组比较无统计学意义(P＞0.05)。见表1，各组CyclinD1 染色情况见图1A－F。

图1 实验各组瘤组织CyclinD1 表达情况(SP×400)

表1 复方阿胶浆对LLC组织CyclinD1、CD44 表达的影响(，n=8)

表1 复方阿胶浆对LLC组织CyclinD1、CD44 表达的影响(，n=8)

注:与模型对照组相比，* P＜0.05。

2.1.2 各组对瘤组织CD44 表达的影响 复方阿胶浆组、CTX组、复方阿胶浆大、中剂量联合CTX组能下调CD44的表达，AOD值分别为(0.195 9±0.014 0、0.191 9±0.022 5、0.191 1±0.022 4、0.184 3±0.024 8)，与模型组比较(0.225 0±0.027 4)有统计学意义(P＜0.05);联合用药各组与单用CTX组比较无统计学意义(P＞0.05)，见表1，各组CD44 染色情况见图2A－F。

2.1.3 瘤组织CyclinD1 与CD44 线性相关性 经直线相关性检验，CyclinD1 与CD44 二者相关系数为r=0.232 21(P＞0.05)，表示二者之间无明显线性相关关系，见表2。

表2 六组LLC组织的CyclinD1 与CD44的相关性()

表2 六组LLC组织的CyclinD1 与CD44的相关性()

图2 实验各组CD44 表达情况(SP×400)

2.2 复方阿胶浆对各组小鼠生存期的影响 实验证明，复方阿胶浆组的生存时间最长，约(27.3±6.9)d;模型对照组的生存时间最短，约(17.6±4.3)d，二者经t 检验，差异有统计学意义(P＜0.01)。经Kaplan－Meier 法生存分析，各组间均无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 复方阿胶浆对荷lewis 肺癌鼠生存期的影响(，n=8)

表3 复方阿胶浆对荷lewis 肺癌鼠生存期的影响(，n=8)

注:与模型组比，＊＊P＜0.01。

3 讨论

3.1 Cyclin D1的表达与肺癌的关系 Cyclin D1 是G1/S 期过渡的重要调控因子，可刺激周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)介导Rb 基因蛋白产物的磷酸化，使Rb基因对细胞生长的抑制效应失活，从而使细胞周期进入DNA 合成期，病理状态下即可使细胞转化成肿瘤细胞。大多数学者认为Cyclin D1 单独或与另外的癌基因编码产物共同参与肺癌的发生。如贺骏等人对包括肺癌在内的多种肿瘤研究发现，正常组织中不表达或者低表达Cyclin D1，而在肺癌组织中表达率高达56.8%，明显高于正常组织，即提示了Cyclin D1 在肺癌形成中可能起了至关重要的作用［11］。刘洁等人对女性肺腺癌患者研究发现Cyclin D1 表达高者，肿块形成大，亦提示了肺腺癌的形成与Cyclin D1的高表达有关［12］。进一步多个小样本研究发现Cyclin D1 蛋白的表达与肺癌患者吸烟与否、肿瘤大小、疾病分期相关，与分化程度、淋巴结转移情况关系不确切，吸烟、肿块大、分期晚者，Cyclin D1 表达阳性率高，并可能是Ⅰ期非小细胞肺癌患者极有意义的预后因子［13－16］。Cyclin D1 蛋白表达对肺癌患者的危险分层、病情评估、预后有一定的临床应用价值。

近年来在干预Cyclin D1 表达进而防治肺癌的研究中我们发现中药制剂越来越多，如消积饮可能通过降低小鼠lewis 肺癌细胞Cyclin D1的表达从而抑制lewis 肺癌生长［17］;肺抑瘤合剂配合化疗能有效抑制肿瘤细胞Cyclin D1、p53的表达，进而发挥其抗肿瘤作用［6］。有一项研究初步显示了中药在干预CyclinD1中不同于西药的优势所在，双黄升白颗粒对骨髓抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠的细胞周期具有双重调控作用，能够上调骨髓CDK4、CDK6、CyclinD1 表达、下调肿瘤组织CDK4、CDK6、CyclinD1 表达［18］，从而在发挥抗肿瘤效应的同时，又能促进骨髓造血功能，即有减毒性。

3.2 CD44的表达与肺癌的关系 CD44 是黏附分子家族的一员，有多种亚型，介导黏附，参与淋巴细胞的归巢和活化，参与信号转导、参与造血等，发挥着广泛的生物学效应，近年来已经发现它在恶性肿瘤的发生发展中也起到了重要的作用，尤其是对肿瘤的侵袭、转移与预后。既往研究对CD44 基因在肺癌中的表达情况报道结果不一，甚至相反。近两年国内研究普遍认为，CD44 与肺癌的组织学类型、分化程度、淋巴结转移及生存时间相关，而与年龄、肿瘤大小、性别、TNM分期无关［19－22］，用到的实验方法多数为免疫组化，少数用到RT－PCR。目前有关拮抗CD44、下调其表达水平的试验药品比较鲜见，如有学者研究益肺清化膏的抗癌机制时发现其可下调CD44、CD44v6的表达水平，推测该药可能通过减弱肿瘤细胞与血管内皮ECM 间的异质黏附，降低肿瘤向基质的侵袭，而达成抗肿瘤的目标［23］。张培彤等人采用流式细胞计数法研究了苏木及联合化疗的抗肿瘤机制，与模型组比较，可在不同时期明显下调CD44的表达水平［24］。

本实验基于前期复方阿胶浆对lewis 肺癌抑瘤率、外周血象及其他因子的表达的影响研究基础上发现，复方阿胶浆组、复方阿胶浆大剂量联合CTX组能明显下调cyclinD1的表达水平(P＜0.05);复方阿胶浆组、CTX组、复方阿胶浆大、中剂量联合CTX组能下调CD44的表达，与模型组比较有统计学意义(P＜0.05)。推测复方阿胶浆的抗肿瘤效应可能与干预CyclinD1/CDK4 激活的信号通路、下调CD44的表达从而影响肿瘤细胞的活动能力相关。本研究未发现CyclinD1 与CD44的表达有明显的统计学相关性，可能二者的作用途径不存在交叉性。在观察生存期的实验中发现复方阿胶浆组的生存时间最长，与模型对照组有明显的差异。虽然经Kaplan－Meier 法生存分析，未发现在统计学上的差异性，但复方阿胶浆在抗肿瘤、下调上述指标表达的同时，仍有延长生存期的趋势，今后有待联合多个指标进一步的研究。

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