疮灵液胶原对创面愈合的促进作用

任晓梅，姚 昶，朱永康，赵 辉，何 鹏，陈 灵，乐音子，曹东阳，郭檬檬

(1江苏省中医院，南京210029;2南京中医药大学)

疮灵液是江苏省中医院于20世纪80年代研制并在临床应用的一种纯中药不含汞外用药液制剂，由大黄、红花、诃子、黄蜀葵花等药物组成。我们的前期研究［1～4］证明疮灵液有较好的抗炎和促进伤口愈合的作用。进一步实验显示疮灵液抑制血管新生并呈现一定的剂量依耐性，载入修饰后胶原后可以改善其抑制血管新生的作用，有利血管成熟，发挥了各自的优势［5］。近来，我们观察了疮灵液胶原对大鼠背部机械性创面愈合的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1．1 实验材料 雄性SPF级SD大鼠48只，体质量200～220 g，江苏省中医院动物实验中心饲养，饲养环境温度为(22±2)℃、湿度为40% ～50%、人工光照(12 h正常明暗周期)，自由摄取专业动物饲料。疮灵液原液由江苏省中医院制药厂生产，批号:950118，pH 为 7．4，生药 1 g/mL，取 0．2 mL 均匀载入直径1 cm、厚度0．2 cm的修饰后胶原中，接着于－50℃冻干形成疮灵液胶原。TNF-α试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。

1．2 实验方法 将48只大鼠随机分为4组，各12只，组内编号，分别为对照组、胶原组、疮灵液组、疮灵液胶原组。4组大鼠腹部注射麻醉后，于背部制作机械性全层皮肤创面，创面直径1．5 cm，呈圆形，深及皮下肌筋膜。将大鼠创面的创缘以塑料垫圈(内径1．5 cm)缝合固定。对照组以0．2 mL生理盐水载入纱布覆盖创面，胶原组用胶原覆盖创面，疮灵液组以疮灵液0．2 mL载入无菌纱布中覆盖创面，疮灵液胶原组以疮灵液胶原覆盖创面，外层无菌敷料包扎，隔日更换。造模时及造模后第3、7、14、28天测定创面面积，造模后第3、7天测创面炎症积分，造模时及造模后第3、7天取创面肉芽组织用于检测TNF-α、IL-6。①创面面积测定:用Image J软件测定创面面积［3］。②创面炎症积分:创面渗液性状分为血清样、浆液样、混浊样;渗液量为极少量、少量、中量、大量时分别计为1、2、3、4 分［3］，渗液量以浸透纱布的层数来观察(＜1层为极少量，≥1层但＜4层为少量，≥4层但＜8层为中量，≥8层为大量)，创面愈合为0分。③肉芽组织中TNF-α、IL-6测定:将标本称重后予以低温(4℃)匀浆，按试剂盒说明测定450 nm处光密度值(OD值)，通过标准曲线得出TNF-α与IL-6含量，然后除以肉芽组织的质量(g)，得到该标本的TNF-α、IL-6含量。

1．3 统计学方法 采用SPSS18．0统计软件。计量资料以¯x±s表示，比较用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组大鼠创面面积比较 结果见表1。造模时各组的创面面积均为1．6 cm2。治疗第3天，与对照组及疮灵液组相比，胶原组创面面积开始减小。治疗第7天，各组创面均显著减小，胶原组与疮灵液胶原组减小至造模时的1/3左右，是对照组及疮灵液组面积的1/2左右。治疗第14天，胶原组与疮灵液胶原组创面已趋向愈合，疮灵液组创面面积亦显著小于对照组。治疗第28天，各组创面均趋向愈合，其中胶原组与疮灵液胶原组完全愈合，另两组仍有一半大鼠创面未愈合。

2．2 各组大鼠创面炎症积分比较 结果见表2。治疗第3天，对照组创面炎症积分约4．5分，主要表现为创面中等量浆液样渗液;疮灵液组及疮灵液胶原组创面渗液量显著少于其余各组，表现为少量血清样渗液;胶原组创面渗液量亦少于对照组，炎症积分低于对照组。治疗第7天，各组创面渗液量均显著减少，对照组仍有部分创面渗液为浆液样，其余各组均表现为极少量血清样渗液，炎症积分均低于对照组，疮灵液胶原组积分显著低于胶原组。治疗第14天，各组创面已显著减小，趋向愈合，炎症不明显，故不再评价。

表1 各组大鼠创面面积比较(cm2，¯x±s)

表2 各组大鼠创面炎症积分比较(分，¯x±s)

2．3 各组大鼠创面肉芽组织TNF-α、IL-6含量比较

结果见表3。治疗第3天，对照组TNF-α含量升高，至7天时降低并显著低于造模时。治疗第3天与第7天创灵液组及创灵液胶原组TNF-α均显著低于对照组。IL-6含量变化较TNF-α剧烈，治疗第3天对照组IL-6含量急剧上升至造模时的5～6倍，至第7天时仍为造模时的3～4倍，治疗第3及7天创灵液组及创灵液胶原组IL-6含量显著低于对照组与胶原组，第3天仅为造模时的2倍左右，第7天与造模时含量基本一致;胶原组IL-6含量低于对照组。

3 讨论

近20年来，江苏省中医院用疮灵液治疗皮肤慢性溃疡取得了较好的疗效。我们前期对887例疮疡病例进行临床应用观察，总治愈率为79．8%，总有效率为98．54%，用药后未见有不良反应［2］。药理研究［1］显示，疮灵液具有抑制创面肉芽组织炎症与血栓形成及抑菌作用。进一步研究［5］发现，疮灵液可以抑制血管新生，但载入修饰后胶原后其抑制血管新生的作用得到改善。本研究进一步探讨疮胶原后对大鼠背部机械性皮肤创面愈合的影响及其炎症机制。

表3 各组大鼠创面肉芽组织中TNF-α、IL-6含量比较(ng/L，¯x±s)

创面的愈合需要经过炎症、增殖与塑形三个阶段，其中炎症阶段是愈合的基础，机体内局部各种炎症因子促进或破坏组织的愈合［6］。本研究发现，疮灵液胶原可以促进创面愈合，疮灵液及疮灵液胶原均可显著减少创面的炎症渗液。通过炎症因子TNF-α及IL-6含量观察发现，创灵液虽然抑制创面炎症反应，但不会延迟创面的愈合过程。TNF-α与IL-6是机体在创面愈合过程中产生的参与炎症反应的两种重要细胞因子，具有双重功能，一方面在调节机体免疫、抗感染等方面有着重要作用;另一方面，这两种因子如大量释放，局部浓度过高，会导致局部组织坏死，影响组织增殖与愈合［7］。因此，调节创面炎症因子可以促进创面愈合。董瑶等［8］通过脂肪干细胞降低小鼠创面肉芽炎症因子IL-6含量而促进创面愈合，创灵液胶原显著抑制组织内IL-6及TNF-α的分泌，在应用第7天创面IL-6含量已经降至初始创面含量水平，说明创面愈合完全进入增殖期，而对照组组织IL-6含量仍然是初始含量的4倍。我们认为，创灵液胶原能够干预创面炎症反应而促进成其愈合。

胶原作为生物体各种结缔组织的主要组成分，可在体内降解且降解碎片具有组织相容性，已成为组织工程中应用最广的生物材料。中药载入可以进一步提高疗效［9，10］，胶原经过修饰后可以提高组织相容性及促进血管生成作用，有利于组织修复［11，12］。本研究结果显示，疮灵液胶原可以发挥疮灵液干预创面炎症反应及胶原促进创面血管新生的作用，进而促进创面愈合。

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