Ang-2和VEGF在类风湿关节炎滑膜组织中的表达研究

刘志昂 张 楠

（郑州人民医院骨科，河南 郑州 450053）

Ang-2和VEGF在类风湿关节炎滑膜组织中的表达研究

刘志昂 张 楠

（郑州人民医院骨科，河南 郑州 450053）

目的 研究Ang-2和VEGF在类风湿关节炎滑膜组织中的表达及其对类风湿关节炎血管新生和病情进展的意义。方法 选取34例RA和30例OA患者的滑膜组织，分别用免疫组化方法检测Ang-2和VEGF在类风湿关节炎滑膜组织中的表达水平及二者的相关性。结果 RA滑膜组织衬里层与衬里下层的成纤维细胞、巨噬细胞样细胞、血管内皮细胞均见Ang-2和VEGF的阳性表达分布，两者比较，阳性细胞的染色程度、染色细胞数与分布范围大致相等。RA患者滑膜Ang-2和VEGF表达水平明显高于对照组。结论 Ang-2和VEGF与RA的发生、发展密切相关，VEGF可能通过上调Ang-2促进RA的血管新生.阻抗Ang-2和VEGF有望成为类风湿关节炎治疗新的靶点。

类风湿关节炎；Ang-2；VEGF；免疫组织化学

类风湿关节炎是以累及周围关节为主、多系统损伤的自身免疫系统疾病。它的基本病理改变是慢性滑膜炎，滑膜增生肥厚及软骨血管翳生成引起关节病变、软骨破坏。血管生成过程受多种因子的调节。其中，血管生成素-2（Ang-2）在胚胎发育、女性生殖系统及糖尿病眼病、肿瘤浸润转移、创伤愈合等的血管新生中发挥重要作用，而在RA中的研究很少。我们应用免疫组化方法检测Ang-2和VEGF在RA滑膜组织中的表达情况，探讨Ang-2、VEGF表达的意义以及二者之间的联系。

1 材料与方法

1.1 标本来源及制备

34例RA滑膜取自2005年7月至2011年9月骨科关节镜下滑膜清理或关节置换的RA患者，其中男11例，女23例；膝关节28例，髋关节6例，所有病例均符合美国类风湿协会（ARA）1987年制定的新标准。30例OA滑膜取自同期行骨关节炎手术患者。标本均经 10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规制备4μm厚连续切片。

1.2 试剂、过程与方法

兔抗人Ang-2（BAO-0636）、VEG多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司。采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶标免疫组织化学法（S-P法），所有切片染色按相同条件进行。已知染色阳性的人脐带组织作为阳性对照，PBS置换一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断标准

Ang-2、VEGF免疫组化染色以细胞浆着色成棕黄色或棕褐色为阳性表现，随机选择10个高倍镜视野，计数1000个滑膜细胞，计算阳性细胞百分比，根据染色强度和阳性细胞率的得分乘积进行判断。按染色强度记分：阳性细胞数≤10%为（-），11%～50%为（+），51%～75%为（++），＞75%为（+++）

1.4 统计学处理

计数资料用阳性率表示，分类变量间的比较用χ2检验，相关性分析采用Pearson分析。P＜0.05认为差异具有显著性。

2 结 果

2.1 RA和OA滑膜组织Ang-2染色

抗Ang-2蛋白多克隆抗体的阳性反应主要定位于细胞浆内，也有一部分细胞浆及细胞核均着色，为棕黄色或棕褐色。染色结果为RA组（34例）：阳性25例（73.53%）；染色强度分别为：9例（-），10例（+），8例（++），7例（+++）；OA组（30例）：阳性10例（33.33%）；染色强度分别为：20例（-），4例（+），5例（++），1例（+++）。两组染色阳性率及染色强度比较，P均＜0.05，差异有显著性。

2.2 RA和OA滑膜组织VEGF染色

VEGF的阳性反应主要定位于细胞浆内，为棕黄色或棕褐色颗粒状，有时可见细胞核呈棕黄色。染色结果为RA组（34例）：阳性29例（85.29%）；染色强度分别为：5例（-），7例（+），12例（++），10例（+++）；OA组（30例）：阳性8例（26.67）；染色强度分别为：22例（-），7例（+），1例（++），0例（+++）。两组染色阳性率比较，χ2=22.460，P=0.000，差异有非常显著性。两组染色强度比较，CMH法，χ2=29.8655，P＜0.001，差异有显著性。

2.3 Ang-2、VEGF在RA中表达之间的关系

Ang-2、VEGF在RA组织中的表达有显著相关性。结果见表1。

表1 Ang-2、VEGF在RA中表达之间的关系表

3 讨 论

血管内皮生长因子（VEGF）是相对分子质量34-45KD的高度糖基化的碱性蛋白，通过刺激血管新生促进肿瘤生长和转移，是目前所知作用最强、选择性最高的内皮细胞丝裂原，是肿瘤血管生成过程中的重要调节因子[1]。Ang-2基因位于染色体8p23.1，编码496个氨基酸，主要表达于子宫、胎盘等血管生成活跃的器官中[2]，其表达受多种因素的调节，VEGF、表皮生长因子（EGF）和缺氧等可上调Ang-2表达水平[3]。Ang-2在多种恶性肿瘤中Ang-2表达明显增强[4]，参与肿瘤的血管生成，是肿瘤血管新生的起始及强化因素。

Ang-2对血管新生具有双重作用[5]，主要与局部环境有关，当局部组织中缺乏VEGF时，Ang-2在细胞内扮演Tie-2拮抗剂的角色，它竞争性抑制Tie-2磷酸化，阻止血管周围支持细胞的积聚而抑制血管的发生；当局部组织中VEGF含量丰富时，Ang-2抑制Tie-2受体磷酸化，促进血管长度增加和毛细血管前端移动性内皮细胞的增加，促进血管的新生和增生[6]。

Ang-2和VEGF的相互作用在肿瘤组织中的研究较多，两者在在胶质细胞瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、大肠癌中的高表达表明二者在肿瘤血管新生和转移中发挥了重要的作用[7-8]。

新血管生成被认为是形成和维持RA血管翳的一个重要因素[9]。在肿瘤的一系列研究中，通过靶拮抗Ang-2和VEGF来抑制肿瘤血管形成治疗肿瘤提供新的依据[10-12]；血管生成抑制剂也已经成为RA的一种潜在的治疗药物，抑制血管生成的药物也被证实可有效缓解RA的病情[13]。根据血管翳的多种靶点建立的体外模型，不仅为体外筛选RA治疗药物提供了平台，也验证了以血管翳为治疗RA靶点的可行性[14,15]。

充分认识滑膜血管或血管翳在RA发病过程中的作用，掌握滑膜血管生成的促进和抑制因素，将为基于滑膜血管翳为靶点的治疗提供突破契机。本实验研究证明了Ang-2和VEGF在RA滑膜中的表达，二者阳性表达位置一致，阳性表达率分别高于OA组，其染色强度明显也高于对照组，表明Ang-2与VEGF协同作用，促进内皮细胞的增多和血管长度增加，促进血管新生，从而参与RA滑膜增生和血管翳生成的病理过程。随着研究的进展，在RA中全面治疗过程中，阻止包括Ang-2和VEGF在内的细胞因子对RA血管的形成很重要，也是对生成血管的靶点治疗之一。

[1] Ferrara N.Vascular endothelial growth factor:molecular and biological aspects[J].Curr Top Microbiol Immunol,1999,237(1):1-30.

[2] BhanooriM,Arvind Babu K.The vascular endothelial growth factor VEGF untranslated region polymorphism and increased risk:a case control study [J].Hum Reprod,2005,20(7):1844-1849.

[3] Krikun G,Schatz F.Expression of angiopoietin-2 by human endometrial endothelial cells[J]Biochem Biophys Res Commun,2000, 275(1):159-163.

[4] Wang J,Wu K.Expressions and clinical significances of angiopoietin-1,-2 and Tie2 in human gastric cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2005,337(1):386-393.

[5] Veikkola T,Dual AK.Role of angiopoietin-2 in pastnatal angiogenesis and lymphangiogenesis[J].Dev Cell,2002,3(3):302-304.

[6] Ahmad SA,Liu W.Differential expression of angio-poietin-1 and angiopoietin-2 in colon carcinoma.A possiblemechanism for the initiation of angiogenesis[J].Cancer,2001,92(5):1138-1143.

[7] 王爽,张晓玲.Ang-2、VEGF在卵巢子宫内膜异位症中表达及相关性研究[J].实用妇产科杂志,2010,26(8):594-597.

[8] 宋聚民,王晓丰.Ang-2、VEGF 在乳腺癌中的表达及意义[J].现代肿瘤医学,2010,18(6):1126-1128.

[9] TsaiCY, Shiau AL. Amelioration of collagen-in-duced arthritis in rats by nanogold[J].Arthritis Rheum,2007,2(56):544.

[10] Brown JL,Cao ZA. A humanmonoclonal anti-ANG2 antibody leads to broad antitumoractivity in combinationwith VEGFl[J]. MolCancerTher,2010,9(1):145-156.

[11] GaurP,Bose D.Targeting tumor angiogenesis[J]. Semin Oncol, 2009,36(2 Suppl1):S12-19.

[12] Hu B,Cheng SY.Angiopoietin-2:development of inhibitors forcancer therapy[J].Curr Oncol Rep,2009,11(2):111-116.

[13] Robinson AJ,Taylor DH.Infiiximab therapy reduces periodontoid rheumat-oid pannus formation [J].Rheumatology,2008,47(2):225-226.

[14] NozakiT,Takahashi K.Development of an ex vivo cellularmodelof rheumatoid arthritis:critical role ofCD14-positive monocyte[J]. ArthritisRheum,2007,56(9):2875-2885.

[15] Ibold Y,Kaps C.Development of a high-throughput screening assay based on the 3-dimensional pannus model[J]. BiomolScreen, 2007,12(7):956-965.

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1671-8194（2013）25-0125-02