大鼠脑缺血损伤后MDA含量和SOD活性变化及胡黄连苷Ⅱ干预作用

钟 亮张 睿纪晓军吴艺玲徐 琦黄 惠

（1 青岛市第三人民医院神经内科，山东 青岛 266041；2 青岛大学医学院附属医院ICU，山东 青岛 266003）

大鼠脑缺血损伤后MDA含量和SOD活性变化及胡黄连苷Ⅱ干预作用

钟 亮1张 睿2纪晓军2吴艺玲2徐 琦2黄 惠2

（1 青岛市第三人民医院神经内科，山东 青岛 266041；2 青岛大学医学院附属医院ICU，山东 青岛 266003）

目的 通过正交试验优化胡黄连苷Ⅱ治疗大鼠脑缺血损伤的最佳剂量和时间窗。方法 应用双侧颈总动脉结扎法（BCCAO）建立大鼠前脑缺血模型，按照正交试验设计分组，经腹腔注射胡黄连苷Ⅱ干预治疗，硫代巴比妥酸法测定血清和脑组织中脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量。黄嘌呤氧化酶法检测血清和脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果 胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的最佳效果，根据血清和脑组织MDA含量分析，均为脑缺血1.5h腹腔注射10mg/kg体质量。根据血清和脑组织SOD活性分析，均为脑缺血1.5h腹腔注射20mg/kg体质量。结论 从用药剂量最小化和治疗时间窗最大化的角度综合评价，胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的最佳治疗时间窗和剂量为脑缺血1.5 h腹腔注射10～20mg/kg体质量。

胡黄连苷Ⅱ；脑缺血；剂量；时间窗；MDA；SOD；大鼠

脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量可以反映组织自由基的含量和脂质过氧化程度[1-2]。生理情况下，体内抗氧化系统将体内不断生成的自由基清除，维持动态平衡[3]。当体内氧自由基（OFR）生成增多时，超氧化物歧化酶（SOD）与超氧阴离子反应生成过氧化氢，再由过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化酶转变为水，清除OFR。因此，SOD的活性反映了机体清除OFR的能力[5]。细胞培养证实，胡黄连苷Ⅱ可减轻H2O2诱导的PC12细胞损伤，提高细胞存活率[5-7]。动物实验表明，胡黄连苷Ⅱ能够抑制大鼠脑缺血再灌注（MCAO/R）后缺血半影区相关炎性因子表达和细胞凋亡，改善大鼠的神经行为功能[8-10]。作者前期研究结果显示，胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的最佳治疗时间窗和剂量为脑缺血1.5h腹腔注射20 mg/kg[11]。本实验旨在检测血液和脑组织匀浆中MDA水平和SOD活性变化，探讨胡黄连苷Ⅱ在脑缺血损伤中的抗氧化作用及最佳治疗剂量和时间窗。

1 材料与方法

1.1 动物模型

成年健康雄性SPF级Wistar大鼠30只，体质量230～250g，青岛市药物检验所实验动物中心提供（SCXK（鲁）20100010）。动物置实验室适应环境一周，自由进食、饮水；室温（23±2）℃，自然光照。随机取5只为假手术组，其余动物分离并结扎双侧经总动脉建立前脑缺血模型[12]。术前动物禁食12h，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3mL/kg），仰卧固定、无菌操作，术后2h仍未苏醒或死亡的4只动物剔除，将成功的21只模型再随机分为模型组5只和治疗组16只。假手术组不结扎颈总动脉，其余操作同实验组。

1.2 设计分组

将治疗组16只动物模型纳入统计范围，按二因素四水平[L16（45）]正交试验设计分组（表1）。治疗时间窗为A因素，设缺血1.0h、1.5h、2.0h、2.5h四个水平；治疗剂量为B因素，设5、10、20、40mg/kg体质量四个水平。

1.3 干预措施

胡黄连苷Ⅱ（CAS No：39012-20-9，纯度＞98%）由天津奎青医药公司提供，应用生理盐水溶解稀释成1%溶液，按[L16（45）]正交表设计，在相应的缺血时间腹腔注射相应剂量胡黄连苷Ⅱ。假手术组和模型组术后2h腹腔注射等量生理盐水。

表1 [L16（45）]正交试验设计分组

1.4 标本采集

大鼠给药24h后，以10%水合氯醛0.3mL/kg腹腔注射麻醉，开胸经心脏取血4mL，4000 r/min离心10min，分离血清，-20℃保存。然后经心脏灌注生理盐水200mL，快速开颅，完整取脑，切除嗅球和额叶前部脑组织，自视交叉（Bregma 0.00mm）向后切取缺血部位脑组织500mg，置预冷研钵中研磨至粉末状后按1∶4比例加细胞裂解液（碧云天生物技术研究所），超声波匀浆，4℃冷冻离心机（Eppendorf 5801型，德国）12000r/min离心10min，去沉淀组织留上清液，BCA法测定蛋白浓度，-20℃保存。

1.5 检测指标

应用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法分别测定血清和脑组织匀浆MDA水平和SOD活性。按试剂盒（南京建成生物科技公司）说明书操作，取血清或脑组织匀浆室温复溶，离心取上清100μL，以紫外分光光度计（Beckmann DU640，USA）在波长532nm（MDA）和550nm（SOD）处测定吸光度值，计算MDA（mmol/L）含量和CAT（U/mL）活性。

1.6 统计学处理

用SPSS 17.0软件进行数据统计。根据不同水平的缺血（给药）时间和剂量，及给药时间和剂量的交互作用对检测指标是否有显著性影响，得出最佳剂量和时间窗。

2 结 果

2.1 检测结果

造模后动物血清和脑组织MDA含量较假手术组均显著升高，而SOD活性均显著降低。治疗后血清和脑组织MDA含量较模型组均显著减低，而SOD活性均显著升高。见表2。

表2 MDA和SOD检测结果

2.2 MDA含量方差分析

因素A（时间）的不同水平对脑缺血后血清MDA含量的影响有显著性差异（P＜0.01），而因素B（剂量）和因素C（时间-剂量交互作用）的影响未见显著性差异（P＞0.05）。说明不同水平的给药时间（治疗时间窗）对血清MDA含量有显著性影响，而不用水平的给药剂量对血清MDA含量无显著性影响。给药时间与给药剂量之间也无显著性交互作用。应用最小显著差数法（LSD）对各组数据进行两两比较显示：血清MDA含量在给药（缺血）时间1.0h（A1）与2.5h（A4）、1.5h（A2）与2.5h（A4）之间有显著性差异（P＜0.05），其余给药时间比较均无显著差异（P＞0.05）；血清MDA含量在不同水平的给药剂量之间均无显著差异（P＞0.05）。根据给药剂量最小化和治疗时间窗最大化原则分析，以A2B2组合最好，即胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的最佳治疗时间窗和给药剂量为脑缺血1.5h腹腔注射10 mg/kg体质量。

不同水平的给药时间或治疗时间窗（因素A）对脑组织中MDA的含量有显著性影响（P＜0.01），而不用水平的给药剂量（因素B）对MDA含量无显著性影响（P＞0.05），给药时间与给药剂量（因素C）之间也无显著性交互作用（P＞0.05）。LSD两两比较显示：脑组织中MDA含量在给药（缺血）时间1.0h（A1）与2.5h（A4）、1.5h（A2）与2.5h（A4）之间有显著性差异（P＜0.05），其余给药时间水平之间均无显著性差异（P＞0.05）；在不同水平的给药剂量之间均无显著差异（P＞0.05）。根据给药剂量最小化和治疗时间窗最大化原则分析，以A2B2组合最好，即胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的最佳治疗时间窗和给药剂量为脑缺血1.5h腹腔注射10 mg/kg体质量。见表3。

表3 MDA含量方差分析

2.3 SOD活性方差分析

因素A（时间）和因素B（剂量）的不同水平对脑缺血后血清SOD活性的影响均有显著性差异（P＜0.01），而因素C（时间-剂量交互作用）的影响未见显著性差异（P＞0.05）。说明不同水平的缺血时间即治疗时间窗和给药剂量对血清SOD活性均有显著性影响，而给药时间与给药剂量的交互作用对血清SOD活性无显著性影响（P＞0.05）。LSD两两比较显示：血清SOD的活性在给药（缺血）时间1.5h（A2）与2.5h（A4）、2h（A3）与2.5h（A4）之间有显著性差异（P＜0.05），其余给药时间比较均无显著性差异（P＞0.05）；在给药剂量5mg（B1）与20mg（B2）、20mg（B3）与40mg（B4）之间有显著性差异（P＜0.05），其余给药时间比较均无显著性差异（P＞0.05）。根据治疗时间窗最大化和用药剂量最小化原则，以A2B3组合最好，即最佳治疗时间窗和治疗剂量为脑缺血1.5h腹腔注射20 mg/kg体质量。

缺血时间即治疗时间窗（因素A）对脑缺血后脑组织中SOD的活性有显著性影响（P＜0.05），而给药剂量（因素B）和时间-剂量交互作用（因素C）对SOD活性的影响无显著性差异（P＞0.05）。LSD两两比较显示：脑组织中SOD的活性在给药（缺血）时间1.0h（A1）与1.5h（A2）、1.5h（A2）与2.0h（A3）1.5h（A2）与2.5h（A4）、2.0h（A3）与2.5h（A4）之间无显著性差异（P＞0.05），其余给药时间比较均有显著性差异（P＜0.05）；在给药剂量10mg（B1）与40mg（B2）、20mg（B3）和40mg（B4）之间有显著性差异（P＜0.05），其余给药时间比较均无显著性差异（P＞0.05）。从治疗时间窗最大化和用药剂量最小化的角度考虑，以A2B3组合最好，即最佳治疗时间窗和治疗剂量为脑缺血1.5h腹腔注射20 mg/kg体质量。见表5。

表4 SOD活性方差分析

3 讨 论

动物实验表明，胡黄连苷Ⅱ能改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经行为功能，这一作用与胡黄连苷Ⅱ提高大鼠脑组织的抗氧化能力、减少脑缺血再灌注所致的氧化性损伤有关[13-15]。细胞培养证实[5-7]，胡黄连苷通过提高细胞内抗氧化酶活性抑制自由基产生，发挥抗脂质过氧化损伤作用。顾伟等[16]研究发现，胡黄连苷Ⅱ对氧化应激损伤L-02细胞具有保护作用，其机制可能与降低细胞内反应性氧（ROS）的含量，进而抑制细胞线粒体膜电位的降低有关。本实验检测指标中，MDA可以直接反应出脑缺血损伤时体内自由基含量的变化，SOD则可以体现脑缺血损伤时体内抗氧化酶活性的变化。按[L16（45）]正交试验设计分组，大鼠脑缺血1h、1.5h、2h和2.5h四个时间点，分别给予胡黄连苷Ⅱ5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg四个剂量，通过检测MDA和SOD指标结果表明，给药时间和用药剂量对于胡黄连苷Ⅱ的治疗效果有显著性差异，不同检测指标最佳组合结果不尽一致，从用药剂量最小化和治疗时间窗最大化的角度考虑，以A2B2和A2B3组合最好，即最佳治疗时间窗和剂量为脑缺血1.5 h腹腔注射10～20mg/kg体质量。本研究仅观察了以上指标的变化，难免有所偏差。因此，胡黄连苷Ⅱ的确切作用机制和最佳治疗时间窗和给药剂量尚有待于结合其他检测指标综合评价。

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The Effect of PicrosideⅡ on the Concentration of NO and the Activity of GSHPx after Cerebral Ischemic Injury in Rats

ZHONG Liang1, ZHANG Rui2, JI Xiao-jun2, WU Yi-ling2, XU Qi2, HUANG Hui2
(1 Department of Neurology, the Third People’ Hospital of Qingdao, Qingdao 266041, China; 2 The Affiliated Hospital of Medical College Qingdao University, Qingdao 266003, China)

Objective To optimize the therapeutic dose and time window of picrosede Ⅱin cerebral ischemic injury in rats by orthogonal test.Methods The forebrain ischemia models were established by bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) methods.The successful models were randomly grouped according to orthogonal experimental design and treated by injecting picroside Ⅱ intraperitonenally at different ischemic time with different dose.The concentration of lipid perioxide malondialdehyde (MDA) in serum and tissue of was determined by thiobarbituric acid assay.The activity of superoxide dismutase (SOD) in serum and brain tissue was determined by xanthine oxidase assay.Result The optimized composition of the therapeutic dose and time window of picroside Ⅱ in cerebral ischemic injury was ischemia 1.5h with 10mg/kg body weight according to the concentration of MDA in serum and brain tissue, ischemia 1.5h with 20mg/kg body weight according to the activity of SOD in serum and brain tissue. Conclusion From the principle of lowest therapeutic dose with longest tome window, the optimized composition of the therapeutic dose and time window of picroside Ⅱ in cerebral ischemic injury is ischemia 1.5h with 10-20mg/kg body weight.

Picroside Ⅱ; Cerebral ischemia; Therapeutic dose; Time window; SOD; MDA; Rats

R364

B

1671-8194（2013）22-0005-03

山东省自然科学基金项目（ZR2011HM050）